组织工程学血管构建中脐带内皮细胞分离及冻存技术的初步研究.pdf
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1、中国心血管病研究杂志2 0 0 4 年1 月第2 卷第t 期t Ilu e , e o - l o f C a r d io v a s c u l a r R e v ie w J =u r y 2 0 0 4 , V o l . 2 , N o . 1 基础研究 文章编号1 6 7 2 一 5 3 0 1 ( 2 0 0 4 ) 0 1 一 0 0 5 7 一 0 4 组织工程学血管构建中脐带内皮细胞分离及 冻存技术的初步研究 2 0 0 0 3 2 上海市, 复旦大学附 属儿科医院心血管中 心外科 蒋红军贾 兵 陈张根 王 克强. 关键词组织工租学; 内皮细胞; 细胞冻存; 细胞培养 摘
2、要目 的为制备组织工程学血管随时 提供种子细胞, 对人脐静脉内皮细胞分离、 体外培养、 传代及鉴定方法进 行研究 、 并研究其冻存技术, 探讨建立脐带血管内 皮细 胞库的可能性。方法新鲜膝带4 9 条, 膝静脉内 灌注消化岭 消 化, 获 得内 皮细胞, 进行体外培养, 相差显很镜下 跪察醉消化结果及所获内 皮细 胞贴璧生长规律; 未用V 皿因 子免 疫荧 光染色 . 鉴定所获内皮细胞及其纯度; 加入冻存液, 呈于液氮进行保存, 复苏后, 分别进行台纷蓝拒染试验及 M T 1 还原试脸, 绘制细胞生长曲线。结果血管内 灌注消化液法可获得取高纯度的内 皮细胞, 肤酶和肤原酶ix合 灌注法消 化结
3、果优于单纯肤酶及肤酶和E D T A组. 各组消 化时间均以1 0 - 1 5 m in 为 佳; 混合踌消 化组细 胞获得率 及 贴壁结果均较其他二组为优。与未冻 存细胞相比, 复苏的细胞活力保持在9 5 %以上。复苏 后的内皮细胞的生长曲 线与未冻存细 胞的生长曲线无差异。结论膝静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内 皮细 胞, 混合酶消化 法消化效果最佳, 经 体外培养扩增后, 可提供足够数量及纯度的内 皮细胞。冻存的内 皮细 胞复苏 后仍保持较高的活 力及休外增殖能力, 能 及时 提供制备组织工 程学血管的种子细 胞来源。 H U MA N U MB I L I C A L E N
4、D O T H E L I A L C E L L C R Y O P R E S E R V I N G T E C H N I Q U E A N D C E L L C U L T U R E D U R I N G C O N S T R U C T I O N O F T I S S U E E N G I N E E R E D V A S C U L A R G R A F T J i a n g H o n g j u n , J i a B i n g , C h e n Z h a n g g e n , e t a l . I a e p a r y rn e n t o
5、 f c a r d i o v a s c u l a r s u r g e r y , C h i l d r e n H o s p i t a l o f F u n d a n U n i ur s i t y , S h a n g h a i 2 0 0 0 3 2 K e y w o r d s t i s s u e e n g n e e r i n g ; e n d o t h e l i a l c e l l ; c r y o p r e s e r v a t i o n ; c e l l c u l t u r e A b s t r a c t O b
6、j e c t i v e T o p r o v i d e s u i t a b l e s o u r c e c e l l s i n t i m e t o c o n s t r u c t t i s s u e e n g i n e e r e d v a s c u l a r g r a f t s , a n d t o i n v e s t i g a t e t h e i s o l a t io n , i d e n t i f i c a t io n , c u l t u r e a n d c r y o p r e s e r v a t i
7、o n t e c h n i q u e s o f h u - m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s i n v i t r o . D i g e s t i v e e f f e c t s o f t h r e e d i f f e r e n t d i g e s t i v e s o l u t io n s w e r e a l s o i n v e s t i g a t e d i n t h i s s t u d y . Me t h o d s 4 9 h u m
8、a n n e w b o r n u m b il i c a l c o r d s w e r e u s e d i n t h i s s t u d y E n d o t h e l i a l c e l l s w e r e i s o l a t e d b y m e a n s o f f i l l i n g d i g e s t i v e e n z y m e s o l u t i o n i n t o t h e l u m e n o f u m b i l i c a l v e i n s . T h r e e k i n d s o f d
9、 i g e s t i v e s o l u t i o n ( t r y p s i n o n l y ; t r y p s i n a n d c o l l a g e n a s e , t r y p s i n a n d e t h y l e n e d i - a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) w e r e a p p l ie d i n t h is s t u d y . T h e d i g e s t i o n r e s u l t s a n d e n d o t h e l ia l c e
10、l l s g r o w t h w e r e m o n i t e r e d b y p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e . T h e i d e n t i t y a n d p u r i t y o f e n d o t h e l i a l c e l l s w e r e p r o v e d b y v o n Wi l l e b r a n d f a c t o r i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g . E n d o t h e
11、 l i a l c e l l s w e r e s u s p e n d e d a n d c r y o p r e - s e r v e d i n l i q u i d n i t r o g e n . O n e p a r t o f p o s t t h a w e d e n d o t h e l ia l c e l l s a n d n o n 一 f r o z e n c e l l s w e r e u s e d t o M T “ T ( 3一( 4 , 5一d i m e t h y l t h ia z o l 一2一y 1 ) 一2 ,
12、 5一d i p h e n y l t t e t r a z o l i u m b r o m i d e ) t e s t , R e l a t i v e s p r e a d i n g w a s s t u d i e d b y d a i l y o b s e r v a t io n a n d p h o t o g r a p h y b y p h a s e c o n t r a s t m i c r o s cop e . P o s t t h a w e d e n d o t h e l ia l c e l l s v i t a b i l
13、 i t y w e r e d e t e r min e d b y t y o p h e n o l b l u e t e s t 一 R e s u l t s E x t r e m e l y h i g h l y p u r i f i e d e n d o t h e l i a l c e l l s c o u l d b e i s o l a t e d b y in f u s i n g d i g e s t i v e s o l u t io n s t o t h e l u m e n o f h u m a n u m b i l i c a l
14、 v e i n s A m o n g t h e t h r e e d ig e s t i v e s o l u t i o n s , d i g e s t i v e e f f e c t o f t h e m i x t u r e o f t r y p s i n a n d c o l l a g e n a s e w a s 复旦人学附属中山医院心研所 万方数据 中国 心血管病研究杂志2 0 0 4 年1 月第2 卷第1 期C F d v e_ e J o , * * a o f t ,a r d iw e s c u la r R e o i e w J a
15、n , - 2 0 0 4 . V ) 长期保 存。细胞复存采用3 7 水浴箱中, 1 一 2 m i n内 使细 胞解冻。台盼蓝染色, 计算细胞成活率。 1 . 6 细胞生长曲线 采用四哇氮盐分光比 色测定, 细胞悬液按1 X 1 0 4 / m l 的浓度接种至9 6 孔培养板, 每孔加人2 0 0 0的M1 9 9培养液。每d每孔加人 2 0 川的5 % M T T , 继续培养4 一 6 h , 弃培养液, 加人 D M S O 1 5 0 风 , 充分溶解, 振荡5 一1 0 m i n , 显色, 采用 酶标仪测( )D值( 参考波长为5 7 0 n m ) , 结果以各孔 平均值
16、表示。 1 . 7 细胞鉴定 将适量的内皮细胞悬液滴到载玻 片上, 进行生长, 经4 %的多聚甲醛固定后, 按试剂 盒说明的步骤, 采用姗因子免疫荧光染色 2 结果 血管内 灌注消化液法, 获取的内 皮细胞纯度高 采用不同消化液所获取的内皮细胞, 活力及体外生 长情况有较大的差异。5 m i n时, 各组获得的细胞数 均较少, 细胞碎片不多; 各组消化的时间以1 0 - 1 5 m i n 左右最佳, 活力高, 细胞碎屑少; 消化时间在 2 0 m i n 时, 细胞活力降低, 呈过度消化状态, 细胞碎 屑较多。所有各组体外培养的内皮细胞在培养阻上 容易贴壁, 大多数呈散状分布, 传代周期较短
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- 组织 工程学 血管 构建 脐带 内皮 细胞 分离 技术 初步 研究
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