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1、现代预防医 学2 0 0 5 年第3 2 卷第7 期 M o d e m P r e v e n t i v e M e d i c in e , 2 0 0 5 , V o l . 3 2 , N o . 7 7 8 5 【 检验方法研究】 细菌培养快速药敏与鉴定试验探讨 陈日荣,周美容,李慧冰,邓辉 摘要目的: 探讨用快速方法进行细菌鉴定与药敏试验。方法: 1 . 快速法: 对B a c t/ A L E R T 3 D培养仪显示阳性的 标本进行涂片、 染色、细菌计数, 调整菌液浓度后, 用A T B 鉴定仪配套试条, 直接进行鉴定与药敏试验。2 . 标准法。结 果: 对6 3 例阳性标本
2、用快速法与标准法进行鉴定与药敏试验进行比 较。葡萄球菌, 肠杆菌科细菌, 非发酵菌 ( 以铜绿假 单胞菌为主)菌属符合率为9 5 %以上,菌种符合率 8 9 %至9 5 %以上, 所有药敏试验结果符合率在9 5 %一 9 7 . 2 %。结论: 葡萄球菌, 肠杆菌科细菌, 非发酵菌快速法与标准法的鉴定、 药敏试验符合率高, 效果满意。 关键词I 血培养; 细菌鉴定; 药敏试验 中图分类号I 8 1 1 5【 文献标识码 A【 文章编号1 0 0 3 - 8 5 0 7 ( 2 0 0 5 ) 0 7 - 0 7 8 5 - 0 2 T O S T U D Y ON T HE RA P ID M
3、E T H OD S OF B A C T E R I A DE NI I F I C A T T ON A ND A NT I MI C R O B I A L S U S C E Y 1 1 B I L T T Y T E S T - ING ( A S T ). C H E N R i- r a n g , Z H O U M e i - r a n g , L I H u i - b i n g , e t a l . D ep a r tm e n t of C l i n ic a l la b o r a t o r y,W u y i T C M H o sp it a l o
4、f J ic m g m e n C ity , 5 2 9 0 3 1 . A b s t r a c t : O b j e c t i v e : T o s t u d y t h e r a p i d m e t h o d s o f b a c te r i a i d e n t if i c a t io n a n d a n t im i c r o b i a l s u s c e p t ib ili ty te s t i n g ( A S T ) o f t h e p o s it iv e s a m p l e f o r B a c t / A L
5、E R T s y s t e m . Me t h o d s : B a c te r iu m o f p o s it iv e b a c t e r ia w e re s t r a in e d , s m e a r e d , c l o n ie d a n d a d j u s t e d f o r th e c o n c e n tr a - t i o n , I d e n t i f i c a t i o n a n d A S T w i t h s t r ip s o f th e A T B s y s t e m h a d b e e n d
6、 o n e d i re 吻 R e s u l ts : I n 6 3 p o s i t iv e s a m p l e r e s u l ts o f S t a p h y l o c o c c u s , E n t e r o b a c t e r i a c e a e a n d n o n f e rm e n t e r s ( m o s t o f P s e u d o m o n a s . A e r u g i n o s a ) . T h e r a t e o f c o i n c id e n c e w i th b a c t e r
7、i u m g e n u s w a s o v e r 9 5 %, w i t h b a c t e r i u m s p e c i e s w a s o v e r 8 9 % t o 9 5 % a n d a ll o f t h e A S T c o i n c i d e n c e w a s b e t w e e n 9 5 % t o 9 7 . 2 %. C o n c l u s io n s : B a c t e r i a i d e n t if i c a - ti o n a n d A S T w it h t h e r a p id m
8、e t h o d i n s t a p h y l o c o c c u s , E n t e r o b a c t e r i a c e a e a n d n o n f e r m e n t e r h a s h ig h c o in c id e n c e w i th t h a t o f t h e s t a n d a r d me t h o d s . k e y w o r d : B l o o d c u l t u r e ; B a c t e r i a i d e n t ifi c a t i o n ; A n t im i c r
9、o b i a l s u s c e p ti b i li t y 第3 代全自 动血液细菌培养仪B a c t/ A L E R T 3 D的使用, 与传统的手工方法相比, 在提高阳性检出率方面迈进了一 大步。 但按传统的标准方法 ( 下称标准法) ,当培养仪显示 阳性时还必须经分离培养、转种纯培养 2 个过程,然后才 能进行细菌的鉴定和药敏试验。然而分离培养、 分纯培养 各须2 4 1i 以上的过程。为了 加快鉴定与药敏试验结果提早 发出, 本文探讨直接由全自动血液细菌培养仪显示阳性的 培养瓶直接抽取菌液, 经涂片染色, 初步确定细菌的种类, 再经多功能显微图像分析系统进行细菌浓度计数
10、。根据阳 性培养瓶中细菌浓度,确定吸取培养液用量, 用 A T B 鉴定 仪配套的试验板条进行细菌鉴定与药敏试验。效果满意, 现报告如下: 1 对象与方法 1 . 1 研究对象2 0 0 3 年4 月至2 0 0 4 年 1 0 月初次门诊或住 院病人阳性标本共9 0 例, 其中 血液4 8 份, 体液4 2 份。 1 . 2 仪器B a c t/ A L E R T 3 D全自动血液、体液培养仪, A T B 半自动细菌鉴定系统,均为法国梅里埃公司产品。多 功能显微图像分析系统为北京中科恒生科技有限公司产品。 二氧化碳培养箱,为上海力申科学仪器有限公司制造。 作者单位 广 东省江门 市 五邑
11、 中医院, 5 2 9 0 3 1 作者简介陈日 荣 ( 1 9 4 7 一 ) , 男, 广东省人,副主任检验师。 从事临床检验 3 0 余年, 尤对细菌学、临床化学有较深人的研究 . 1 . 3 培养基 培养瓶为B a c V A L E R T 3 D 配套培养瓶, 包括 需氧瓶、 厌氧瓶, 含中和剂的需氧瓶、厌氧瓶。A T B 半自 动细菌鉴定系统配套的鉴定与药敏试验反应条。 1 . 4 质控菌株大肠埃希氏菌 A T C C 2 5 9 2 2 , 金黄色葡萄球 菌A T C C 2 5 9 2 3 , 铜绿假单胞菌A T C C 2 7 8 5 3 . 1 . 5 标准法 当B a
12、c t/ A L E R T 3 D 培养仪显示阳性时, 从阳 性标本培养瓶中吸取菌液, 转种平板分离培养, 2 4 h 后必 要时挑选菌落转种平板作纯培养, 2 4 h 后按A T B 系统操作 说明书进行细菌鉴定与药敏试验。 1 . 6 快速法 1 . 6 . 1 当B a c t/ A L E R T 3 D 培养仪显示阳性时, 从阳性标本 培养瓶中吸取菌液进行涂片、革兰染色, 作初步的细菌判 断。 1 . 6 . 2 细菌浓度计数 直接从显示阳性的培养瓶中抽取混 匀的培养液, 用无菌生理盐水稀释2 0 0 一 3 0 0 倍, 灌注血球 计数板, 静置2 0 m i n 后,在多功能显
13、微图像分析系统显示 屏进行细菌辨认计数, 求知每毫升培养液的细菌个数。根 据计数结果,不同种类的细菌制备不同浓度的备用菌液: 阴性杆菌制成1 . 5 x 1 护c f u / m l ( 相当0 . 5 麦氏 单位)的菌悬 液, 阳 性球菌制成1 . 5 x 1 护c f u / m l 和6 x 1 护c f u / m l ( 相当 0 . 5 和2 麦氏单位) 的菌悬液, 链球菌制成为1 . 5 x 1 护c f u / m l 和1 . 2 x 1 护c f u / m l ( 相当0 . 5 和4 麦氏 单位) 的菌悬液。 1 . 6 . 3参照A T B 系 统 操作 说明, 将备
14、用菌液分别加入A T B 配套的鉴定、药敏试验板条中进行鉴定与药敏试验,培养 2 4 h , 上机测定鉴定和药敏试验结果。 7 8 6现代预防医学2 0 0 5 年第3 2 卷第7 期M o d e m P re v e n t i v e M e d ic i n e , 2 0 0 5 , V o l . 3 2 , N o . 7 2 结 果 2 . 1 标准法与快速法鉴定试验结果在仪器显阳性的9 0 例标本中, 6 3 例用标准法和快速法同时进行测定, 快速法 鉴定有6 1 例与标准法鉴定菌属结果相同, 5 8 例与标准法鉴 定菌种结果相同。葡萄球菌属, 检出2 7 株菌, 5 个种,
15、 分 别是金黄色葡萄球菌1 1 株, 人葡萄球菌5 株,山羊葡萄球 菌1 株, 表皮葡萄球菌6 株, 溶血葡萄球菌4 株。肠杆菌 科细菌检出 1 9 株菌, 5个种, 分别是大肠埃希氏菌9 株, 克雷伯氏菌6 株,甲付伤寒2 株, 变形杆菌,阴沟肠杆菌 各1 株。非发酵菌检出1 6 株菌, 3 个种, 分别是铜绿假单 胞 1 4 株, 恶臭假单胞菌 1 株, 嗜麦芽窄食单胞菌各 1 株。 嗜水气单胞菌1 株。试验结果见表 t o 表1标准法和快速法在A T 7 系 统鉴定试验结果比 较 ( x 1 0 - 2 ) 菌属鉴定菌种鉴定 细菌 标准法 快速法 ( 株)( 株) 符合率 标准法 快速法
16、 ( 株)( 株) 符合率 8995 95100100 葡萄球菌 肠杆菌科 非发酵菌 嗜水气单胞菌 9 6. 32 7 2 4 1 9 1 6 1 8 1 6 1 9 1 6 1 8 1 5 2 . 2 标准法与快速法药敏试验敏感率比较药敏试验菌属 不同药物选择不同, 葡萄球菌属选择 巧种抗生素, 肠杆菌 属和非发酵菌属选择 1 9 种抗生素。标准法2 7 株葡萄球菌 药敏测试 4 0 5 个, 其中敏感2 9 7 个, 耐药 1 0 8 个,敏感率 7 3 %。 快速法2 6 株葡萄球菌药敏测试3 9 0 个,其中敏感 2 8 6 个, 耐 药1 0 4 个, 敏 感 率7 3 . 3 %
17、. 2 者 经 卡 方 测 验, 扩 = 0 . 1 3 , 差异无统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) 。标准法 1 9 株肠杆 菌科细菌药敏测试3 6 1 个, 其中敏感1 9 0 个, 耐药1 7 1 个, 敏感率 5 2 . 6 %。快速法 1 8 株肠杆菌科细菌药敏测试 3 4 2 个, 敏感 1 8 9 个, 耐药1 5 3 个, 敏感率5 5 . 3 %, 2 者经卡方 测 验, X 2 二 0 . 5 4 , 差 异 无 统 计 学 意 义 ( P 0 . 0 5 ) 。 标准 法 1 6 株非发酵菌药敏测试3 0 4 个, 其中敏感 1 7 0 个, 耐药 1 3 4 个,
18、 敏感率 5 5 . 9 % a 。快速法 1 6 株非发酵菌药敏测试 3 0 4 个, 敏感 1 7 2 个, 耐药1 3 2 个, 敏感率5 6 . 6 %, 2 者经卡方 测 验, X 2 = 0 .0 1 6 , 差 异 无 统 计 学 意 义( P 0 . 0 5 ) 0 2 . 3 标准法与快速法药敏试验符合性比较 2 7 株葡萄球菌 两种方法同时诊断为葡萄球菌属的有2 6 株, 共7 8 0 个药敏 试验, 对同一药物2 法同时表现为敏感或耐药的有7 5 8 个, 符合率卯. 2 %。在1 9 株肠杆菌科2 种方法同时诊断为肠杆 菌属的有 1 8 株, 共6 8 4 个药敏试验,
19、对同一药物2 法同时 表现为敏感或耐药的有6 5 0 个, 符合率9 5 %。非发酵菌2 种方法同时诊断为非发酵菌属的有 1 6 株6 0 8 个药敏试验, 对同一药物2 法同时表现为敏感或耐药的有5 8 2 个, 符合 率9 5 . 7 %。上述葡萄球菌属、 肠杆菌属和非发酵菌属标准 法 与 快速 法药敏试验符合性比 较, 经卡方测验扩= 4 . 7 5 , 差异无统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) 0 在A T B 系统作鉴定试验2 者总符合率比较,以标准法为准, 即6 3 株菌鉴定至属时, 快速法有6 1 个与标准法相符,总 符合 率为%. 8 % ( 6 1 / 6 3 ) , 鉴
20、定至种时, 快速法有5 8 个与 标准法相符, 总符合率为9 2 . 1 % ( 5 8 / 6 3 ) 。经统计学测验, 当 鉴 定 至 属 时, 扩= 0 . 5 , 两者差 异无统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) 。 当 鉴 定 至 种 时X 2 = 4 . 5 7 , 差 异 有 统 计 学 意 义 ( P 0 . 0 5 ) 。当鉴定至种时差异有统计学意义,主要为葡萄球菌 鉴定到种符合率较其它菌种低所造成, 但所幸葡萄球菌在 属和种的药敏结果对临床选择抗菌素治疗无区别。鉴定试 验比 较中葡萄球菌属符合率%. 3 %, 菌种符合率8 9 %.葡 萄 球菌 鉴 定 试 验 符合率比
21、国内 的 一些 报道高 。 肠杆菌 科 属、 种细菌符合率均为9 5 %。 非发酵菌属符合率 1 0 0 %, 种符合率也有9 3 . 7 %. 药敏试验以 属之间进行比较, 上述3 个菌属的药敏试 验经统计学处理差异均无统计学意义。快速法鉴定与药敏 试验能否成功, 关键是备用菌液中细菌浓度准确与否。此 步骤非常重要, 它将影响药敏试验结果的精确度和正确 性2 1 。 通 过多 功能显微图 像分析系统对培养液细菌计数, 能够准确计算培养液中细菌浓度,并根据试验对细菌浓度 的要求配制成备用菌液。也可以直接从培养瓶中吸取菌液 进行鉴 定与 药敏试验川, 但必须注意控制好吸取量, 一般 可 选用5
22、讨至1 0 川 , 浓度过高会造成药敏试验假耐药结 果。相反浓度过低又会造成药敏试验假敏感结果。过高、 过低的浓度同样也影响鉴定试验。 在仪器显阳性的9 0 例标本中, 有2 7 例是不宜用 A T B 系统进行快速鉴定和药敏测试的。其中链球菌、 肠球菌1 1 株,酵母样真菌6 株, 棒状杆菌4 株,莫拉氏菌 2 株,少 动鞘氨醇单饱菌1 株, 混合生长3 例。酵母样真菌、 链球 菌、 肠球菌、快速法鉴定结果不理想,可能由于此类细菌 鉴定要求的菌液浓度高,要求在2 到4 麦氏单位,同时受 体液、 血液等有形成分影响, 干扰了仪器不认读。这2 7 例 标本不能按快速法的试验途径进行, 所以对这2
23、 7 例标本不 宜作2 种方法的比较。但是9 0 例阳性标本,其中革兰阳性 球菌占3 2 %,肠杆菌科细菌占2 2 %,铜绿假单胞菌占 1 6 . 6 %, 3 类细菌共占7 0 %。用快速法可对7 0 %常见细菌 进行快速鉴定和药敏试验,比 标准方法可提前2 4 到4 8 h 发 出鉴定和药敏试验报告, 这对菌血症病人的及早诊断与制 定正确的治疗方案很有实用意义。 另外尚 注意到嗜水气单胞菌标准法与快速法的鉴定和 药敏结果虽然相符 ( 符合率1 0 0 %) , 但仅 1 株, 例数太少, 不作讨论。 参考文献 3 讨论 对只有单一菌种感染的6 3 例标本进行标准法与快速法 1 吴秋梅, 叶晓卉, 崔娴维, 等. B a c t/ A L E R T 检测阳 性的血培养 标本直接用V it e k 进行细菌鉴定的方法探讨 J ,中华医院感 染学杂志, 2 0 0 0 , 1 0 ( 1 ) : 7 7 . 2 蔡文成 . 实用微生物诊断学 【 M . 江苏: 东南大学出版社. 1 9 9 8 . 8 8 8 . 3 汪定成, 张青, 刘树林, 等. 对血培养阳 性标本直接检测的评 估 【 J , 中 华检验医学杂志, 2 0 0 2 , 2 ( 6 ) : 3 7 5 . 收稿日 期2 0 0 5 -0 2 -1 6
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