编码鸡CD8α链无信号肽基因片段的克隆与表达.pdf
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1、安徽农业大学学报, 2006, 33 (1) : 56-60 Journal of Anhui Agricultural University 编码鸡 CD8链无信号肽基因片段的克隆与表达* 谢国化1, 鲍 鸣1, 仲大莲2, 余为一 1* , 李槿年1 (1. 安徽农业大学动物科技学院, 合肥 230036; 2. 中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230026) 摘 要: 应用 RT-PCR 技术, 通过自行设计的 1 对引物以 ConA 诱导的鸡胸腺淋巴细胞 RNA 为模板, 扩增出编 码鸡 CD8 链的无信号肽基因片段, 大小为 651 bp。该片段经酶切初步鉴定后, 被插入 pM
2、D18-T 载体进行测序, 发 现与已发表的鸡 CD8 链基因序列的同源性达 98%。进一步将该片段插入原核表达质粒, 构建 pGEX-4T-1-CD8, 并转化大肠杆菌 BL21。经 IPTG 诱导培养并提取表达蛋白质。在 SDS-PAGE 电泳图谱中可见大小约为 50 000 的 蛋白带, 表明所克隆的编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段在原核细胞中得到表达。 关键词: CD8; 鸡; 克隆; 原核表达 中图分类号: S831. 2; S852. 4文献标识码: A文章编号: 1672-352X (2006) 01-0056-05 Cloning and expression of the
3、gene fragment encoding chicken CD8 chain without signal peptide XIE Guo-hua1, BAO Ming1, ZHONG Da-liang2, YU Wei-yi1, LI Jing-nian1 (1. College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036; 2. College of Life Science,Science and Technology University of China, Hefei 23
4、0026) Abstract: The total RNA was prepared from ConA stimulated thymocytes of a 5-week-old chicken according to the instructions of the trizol reagent. The CD8 alpha chain cDNA without its singal peptide sequence was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)using a pair of
5、 gene specific primers. The obtained 651 bp fragment was identified by restriction enzyme digestion, the fragment was cloned to the pMD18-T vector and sequenced(the sequence has been deposited in GenBank with accession number of DQ202314) . The sequence showed 98% homology with that of published chi
6、cken CD8 alpha chain. Subsequently,the verified fragment was digested with EcoR and Sal and ligated to the pGEX-4T-1 vector using T4DNA ligase. The recombinant pro- karyotic expression plasmid, namely pGEX-4T-1-CD8, was transformed into Escherichia coli strain BL21 (DE3) and expressed as a GST fusio
7、n protein. The products were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and a protein about 50 000 was observed. These suggest that the cloned gene encoding chicken CD8 alpha chain without signal peptide was expressed in prokaryotic system. Key words: CD8; chicken; cloning; prokaryotic expre
8、ssion CD8 分子是一种表达在成熟 T 细胞表面的 I 型 跨膜糖蛋白, 通常为细胞毒 T 细胞的表面标志 1。 研究发现, CD8 分子还是免疫细胞间互相作用的功 能蛋白, 比如在与 TCR-MHC I 类分子共同参与递呈 抗原中的细胞间识别作用。此外在恶性肿瘤及慢性 感染性疾病的免疫反应中也有作用 2, 3。CD8 分子 *收稿日期: 2005-10-06 基金项目: 国家自然科学基金 (30270974) 资助。 作者简介: 谢国化 (1979 - ) , 男, 硕士研究生; 余为一 (1952 - ) , 男, 博士, 教授, 博导。 * 通讯作者 (Corrresponding
9、 author) E-mail: yuweiyi sohu. com 以 CD8 同型二聚体或 CD8 异型二聚体的形式 存在 3, 4。T 细胞表面 CD8 链与 MHC I 分子的 Ig- SF 区域结合, 辅助 TCR 识别 Ag-MHC 复合体, 而 CD8 分子 链的胞内区 p56lck与酪氨酸激酶一起具 有调节 CD3/ TCR 复合体的机能, 在转导 T 细胞增 殖和分化信号中起重要作用 1, 3-6。CD8 链的羧基 端不具有 p56lck结构域, 目前认为 CD8 链仅仅起到 协助 CD8 链发挥其生物学活性的作用 3。鸡和哺 乳动物的 CD8 分子在生物化学和功能上的相似性
10、 很明显, 在鸡的免疫防御中起重要作用 3, 4。为进 一步研究鸡 CD8 分子在免疫中的作用机理, 作者克 隆编码鸡 CD8 链无信号肽片段基因, 并在大肠杆 菌中进行表达, 为制备其相应抗体及研究功能奠定 基础。 1 材料和方法 1. 1 试验材料 1. 1. 1 试验动物 SPF 鸡由安徽某鸡厂提供。 1. 1. 2 菌株和质粒 pMD18-T vector 购自 Takara 公司, DH5、 BL21 和原核表达质粒 pGEX-4T-1 由安 徽农业大学动物科技学院保存。 1. 1. 3 工具酶及试剂 DNA Marker DL 2000、 限制 性内切酶、 T4连接酶、 Taq 酶
11、和 dNTP 购自大连宝生 物工程有限公司; Trizol reagent 购自美国 Invitrogen 公司; 琼脂糖 (电泳纯) 购自上海生工生物工程公 司; 质粒纯化试剂盒、 DNA 清洁/ PCR 产物清洁试剂 盒、 DNA 提取试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限 公司; DNA/ Hind + EcoR、 EB、 氨卞青霉素、 蛋 白质低分子量参照物、 二硫苏糖醇 (DTT) 购自华美 生物工程公司; 胰蛋白胨、 酵母提取物为 OXID 产 品, ConA 购自南京生兴生物公司; 异丙基-D-硫代 半乳糖苷 (IPTG) 和 RNA 反转录试剂盒为 Promega 公司产品。 1.
12、1. 4 引物 根据 GenBank 报道的鸡 CD8 基因 mRNA 序列和原核表达质粒 pGEX-4T-1 多克隆位点 序列用 Primer Premier5. 0 软件辅助设计一对引物: CD8 链上游引物: 5-cccgaattcgcccagggacagaggaaca-3; CD8 链下游引物: 5-gcgtcgactcatatgtgtcgggttggca-3。 两条引物的 5端分别含有 EcoR和 Sal 酶 切位点, 预期扩增片段长度为 651 bp。引物由上海 生工生物工程有限公司合成。 1. 2 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的克隆与 鉴定 1. 2. 1 鸡胸腺淋巴细胞的
13、诱导培养及其总 RNA 的 提取 将 5 周龄的 SPF 鸡心脏采血处死, 无菌取其 胸腺, 在冷 Hanks 液中剪碎, 尼龙网过滤, 用淋巴细 胞分离液分离。洗涤后调整细胞终浓度为 8. 0 106个mL -1, 置无血清、 含 10 gmL-1 ConA 的 RPMI1640 培养液于 40, 5%CO2条件下孵育。7 h 后收集胸腺细胞, 使用 Trizol reagent 提取胸腺细胞 总 RNA。 1. 2. 2 RT-PCR 扩增 将上述抽提的总 RNA 置 42水浴反转录 1 h, 合成 cDNA 第一链, 并以其为 模板, 用 PCR 扩增 CD8 基因片段。PCR 扩增参照
14、 鲍鸣等 7方法进行。PCR 循环参数为: 94 1 min, 58 1 min, 72 2 min, 共 30 个循环, 最后 72 延 伸 8 min。反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 2. 3 RT-PCR 产物单酶切鉴定 反应产物经 Hind在37水浴3 h 后, 用琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1. 2. 4 感受态细胞的制备 参照 分子克隆实验 指南 8进行操作。 1. 2. 5 目的基因片段的克隆与鉴定 RT-PCR 产 物经 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳后, 切下约为 651 bp 的 DNA 凝胶片段, 用 DNA 凝胶回收试剂盒回收产 物。回收的 PCR 产物用 EcoR和 Sa
15、l 双酶切, 再 经 DNA 清洁试剂盒纯化; 以同样方法处理 pGEX- 4T-1。纯化的 PCR 产物与 pGEX-4T-1 经 T4连接酶 连接, 构建成原核表达重组质粒 pGEX-4T-1-CD8, 进一步转化大肠杆菌 BL21, 具体操作参照 分子克 隆实验指南 8。以菌液为模板进行 PCR 鉴定, 提 取重组质粒进行双酶切鉴定。同时构建重组质粒 pMD18-T-CD8, 经 PCR 鉴定后送博亚公司测序。 测序结果用 Blast 和 DNAStar 软件进行同源性分析。 1. 3 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的表达与 鉴定 1. 3. 1 细菌的培养和蛋白质的提取 按照 分子
16、 克隆实验指南 8进行细菌培养和细菌蛋白提取。 1. 3. 2 表达产物的 SDS-PAGE 鉴定 蛋白提取物 用 SDS-PAGE 鉴定, 其浓缩胶为 3%, 分离胶 10%, 其他染色脱色等均参照 分子克隆实验指南 8进行。 2 结果与分析 2. 1 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的扩增和 单酶切鉴定 以 ConA 活化 7 h 鸡胸腺细胞总 RNA 为模板, 经 RT-PCR 得到的产物在琼脂糖凝胶电泳图谱中, 可见预期的目的基因条带大小约为 651 bp。应用 Primer premier 5. 0 软件分析鸡 CD8 链基因序列, 在146 bp 处有一 Hind酶切位点, 将
17、Hind与 RT- PCR 产物进行反应, 获得两条 DNA 片段 (图 1 泳道 7533 卷 1 期谢国化等 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的克隆与表达 2) , 大小分别约为 146 bp 和 505 bp。 2. 2 编码鸡 CD8 无信号肽基因片段的克隆与序 列测定 用 Blast 和 DNAStar 软件分析比较测序结果, 表 明所克隆的基因片段序列 (图 2-C) 与 Tregaskes 等 9和胡青海等10发表的编码鸡 CD8 无信号肽 DNA 片段序列基本一致, 同源性为 98%。其中, 胞 外区的核苷酸序列有15 个碱基 (图2-A, B) 的差异, 分别导致 9 个氨
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