结核分支杆菌铁调控蛋白FURA的基因表达及单克隆抗体的制备.pdf
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1、文章编号: 1 0 0 2 - 2 6 9 4 (2 0 0 5) 0 8 - 0 6 8 5 - 0 3 结核分支杆菌铁调控蛋白F u r A的基因表达 及单克隆抗体的制备* 高雪, 薛莹*, 姜泓, 王平, 柏银兰, 张海, 李元, 徐志凯 摘要: 目的表达结核分支杆菌F u r A蛋白, 并制备针对该蛋白的单克隆抗体 (m A b) 。方法将重组质粒转化入E. c o l iB L 2 1, 挑出阳性克隆,I P T G诱导表达重组的6 *H i s融合蛋白。采用小鼠腹股沟皮下N C膜免疫的方法免疫小鼠, 并进行 细胞融合、 克隆化制备抗F u r Am A b, 用E L I S A法
2、初步鉴定其特异性位点和相对亲和力。结果获得了高表达的融合蛋白, 融 合蛋白经S D S - P A G E分析, 在相对分子量M r为2 3 * 1 0 3处有特异的蛋白条带, 为目的蛋白。用该融合蛋白免疫小鼠后, 获得 了1株抗F u r Am A b。结论所获得的抗F u r Am A b特异性强、 效价高, 对进一步研究F u r A在结核分支杆菌铁代谢及致病中 的作用提供了有力的工具。 关键词: 分枝杆菌, 结核; F u r A; 单克隆抗体 中图分类号: R 3 9 8 , 9 1 文献标识码: - E x p r e s s i o no f g e n e e n c o d
3、i n g t h e i r o n - d e p e n d e n t r e g u l a t o rF u r Ao fM y c o b a c t e r i u t u b e r c u l o s i s a n d t h ep r e p a r a t i o no f i t sL o n o c l o n a l a n t i b o d i e s G A OX u e,X U EY i n g,J I A N GH o n g,W a n gP i n g,B A IY i n - L a n,Z H A N GH a i,L IY u a n,X U
4、Z h i - k a i (D e p a r t m e n t o fM i c r o b i o l o g y,F o u r t hM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,X i a n7 1 0 0 3 3,C h i n a) A B S T R A C T:T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d sw i t h f u r Aw e r e t r a n s f o r m e d i n t oE.c o l iB L 2 1a n d t h ep o s i t i
5、 v e c l o n e sw e r e s e l e c t e d i n o r d e r t o e x p r e s s t h e g e n e e n c o d i n g t h e i r o n - d e p e n d e n t r e g u l a t o rF u r Ao fM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i si np r o k a r y o t i c c e l l s a n d t op r e - p a r e i t sm o n o c l o n a l a n
6、t i b o d i e s . T h e n t h e r e c o m b i n a n t 6 x H i s f u s i o np r o t e i nw a s i n d u c e d t o e x p r e s s b y I P T Ga n dp u r i f i e db yN i - N T A p u r i f i c a t i o n s y s t e m. T h i s p r o t e i nw a s u s e da s a n t i g e n t o i m m u n i z em i c e i no r d e r
7、 t op r e p a r em o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s tF u r A,a n d t h e s p e c i f i c i t y a n d r e l a t i v e a f f i n i t yo fm c A bw e r e d e t e r m i n e db yE L I S A. B yu s i n g t h e s em e t h o d s,f u s i o np r o t e i nw i t hh i g h l e v e l e x - p r e s s
8、 i o nw a s o b t a i n e d,i nw h i c h t h eM r o f t h i sp r o t e i nw a s f o u n d t ob e2 3 *1 0 3a sd e m o n s t r a t e db yS D S - P A G Ea n dW e s t e r nb l o t - t i n g . T h e 6* H i s f u s i o np r o t e i nw a s p u r i f i e db y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y a n
9、d4c l o n e dm c A bw e r eg e n e r a t e d f r o mm i c e i m m u n i z e d w i t hF u r A. T h e a n t i - F u r Am c A b o b t a i n e d s h o w e dh i g h s p e c i f i c i t y a n dh a dh i g h t i t r e s . I t i s e v i d e n t t h a t i t p r o v i d e s a s a u s e f u l r e a g e n t f o
10、r t h e f u r t h e r s t u d yo f f u n c t i o no fF u r Ai n t h e f e r r i c i o nu p t a k e i nM.t u b e r c u l o s i s. K E YWO R D S:M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s;F u r A;m o n o c l o n a l a n t i b o d y 铁是维持结核分枝杆菌 (M y c o b a c t e r i u mt u b e r - c u l o s i s,M
11、T B) 新陈代谢所必需的营养物质之一, 并 且作为其致病性不可缺少的生理条件在结核分支杆 菌的研究中有重要的地位。研究认为通过代谢途径 来调控基因表达从而抑制MT B生长可以达到治疗 结核病的目的 1 。研究铁相关基因在MT B代谢过 程中的作用, 有助于我们深入了解MT B的致病机 理, 从而有效地控制结核病的流行。 MT B中包括四种铁依赖的调节基因, 它们分属 两个家族, 分别为F u r和D t x R。其中, F u r家族又 包括F u r A和F u r B 2 。目前对于D t x R家族蛋白的 结构和功能研究的比较清楚, 而对F u r蛋白的研究 比较少。为此, 我们在大肠
12、杆菌中实现了F u r A的 高表达, 将表达的蛋白纯化后作为免疫原, 制备了高 特异性、 高效价的抗F u r A单克隆抗体 (m A b) , 并进 行了特异性鉴定。为进一步探索其在MT B中的作 用奠定基础。 1 材料和方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 质粒、 菌株、 细胞与实验动物 E.c o l i B L 2 1、E.c o l iD H 5 、MT BH 3 7 R v菌株及S p 2 0细 胞系由本室保存; 重组表达质粒p G E M - F u r A由本 *军队重点课题资助项目 (0 1 z 0 8 3) *通讯作者: 作者单位: 第四军医大学基础部微生物学教研室
13、, 西安 7 1 0 0 3 2 586 2 0 0 5,2 1(8) 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 室构建。B A L B c小鼠 (雌性,6 8w k龄) 由本校实 验中心提供。 1 . 1 . 2 抗血清和试剂 P E G、H T及H A T均为美 国P r o m e g a公司产品; I P T G为S i g m a公司的产品; H i s 6 m A b购自第四军医大学免疫学教研室,H R P- 山羊抗小鼠I g G抗体购自华美生物公司;N i 2 + - N T A纯化试剂盒购
14、自I n v i t r o g e n公司; 胎牛血清购 自杭州四季清公司; 其余一般化学试剂均为国产分 析纯。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 重组表达质粒的构建将p G E M - f u r A被 B a mH I和H i n dI I I双酶切的片段与原核表达载体 p R S E T - A连接, 构建成重组表达质粒p R S E T - A - f u r A. 酶切鉴定正确后进行诱导表达。 1 . 2 . 2 目的蛋白的诱导表达和纯化将重组质粒 p R S E T - A -f u rA转化入E.c o l iB L 2 1中。转化的细 菌在含氨苄青霉素 (5 0m gL)
15、 和氯霉素 (3 5m gL) 的L B培养基中过夜培养, 按1 : 5 0的接种量进行转 接, 3 7 摇菌3h至AE1, 加入异丙基-D硫代 半乳糖苷 (I P T G) 至终浓度为1 . 2m m o lL, 3 7 o C继 续通气培养4 5h。取5m l菌液, 收集菌体, 菌体 加入H 2O8 0L, 剧烈振荡混匀, 再加入2 *样品缓 冲液8 0L, 1 0 0 ,5m i n; 离心1 0m i n;1 2 5g L聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测, 预计相对分子量M r为2 3 * 1 0 3处有明显表达条带。大规模培养细菌, 诱导 表达目的蛋白, 收集菌体, 超声裂菌, 离心后将上清
16、 和沉淀分别制样, 进行可溶性分析。如果目的蛋白 为可溶性的直接用镍离子柱进行亲和层析纯化。 1 . 2 . 3 亲和色谱法纯化目的蛋白采用I n v i t r o g e n 的N i 2 + - N T A纯化试剂盒纯化目的蛋白。将5 0m L 的诱导菌液离心, 制备上柱样品, 按照可溶性条件 (n a t i v e c o n d i t i o n) 进行亲和色谱纯化, 收集洗脱液, - 2 0 保存。 1 . 2 . 4 m A b细胞株的建立 取免疫小鼠脾细胞与 小鼠 骨 髓 瘤 细 胞 S P 2 0融 合,融 合 剂 采 用 P E G 1 5 0 0。融合前一天制备饲养细
17、胞, 融合细胞在 含H A T的培养液中培养5天后改用含H T的培养 液培养至第8天, 用间接E L I S A法检测培养上清, 并以S P 2 0的培养上清与正常B A L B c小鼠的血清 作为阴性对照, 以融合B A L BC小鼠的血清作为阳 性对照。检出的阳性孔用有限稀释法进行克隆化, 建立单克隆细胞株。 1 . 2 . 5 含m A b腹水的制备及纯化将杂交瘤细胞 用无血清培养液混匀, 并将细胞数调至1 - 2 *1 0 6 m l, 每只小鼠经腹腔注射0 . 5m l。接种杂交瘤细胞 后约1 0 - 1 5d, 可见小鼠腹部明显膨大, 抽取腹水, 3 0 0 0 r p m离心1
18、5m i n, 收集上清。采用正辛酸-硫 酸铵法对腹水进行纯化 5 。 1 . 2 . 6 m A b细胞株的初步鉴定 1 . 2 . 6 . 1 间接夹心E L I S A法检测纯化抗体效价 以1 0 g m l浓度包被F u r A蛋白, 再纯化抗体、 辣根 过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体, 并用O P D显色。分 别以S P 2 0细胞培养上清和免疫小鼠血清作阴、 阳 性对照。 1 . 2 . 6 . 2W e s t e r n - b l o t法鉴定纯化m A b特异性 将表达产物进行1 2 5gLS D S - P A G E后转移至硝酸 纤维素膜上, 5 0g L脱脂奶在3 7 o
19、 C封闭1h, 加入 1 0 0g m l纯化m A b, 3 7 o C摇床孵育1h,P B S洗涤 3遍后, 加入H R P -山羊抗小鼠I g G抗体,3 7 摇床 孵育1h, P B S洗涤3遍, 加入底物液O P D显色。 1 . 2 . 6 . 3 m A b类和亚类的鉴定 收集不含血清的 杂交瘤细胞培养上清,用6种类和亚类特异性的羊 抗鼠的多克隆抗体检测培养上清, 呈阳性反应的即 可确定型别。 2 结果 2 . 1 表达载体的构建 p G E M - F u r A经B a mH I和 H i n dI I I双酶切后的目的片段与p R S E T - A进行连 接反应后, 转化
20、入感受态细胞E. c o l iB L 2 1, 经氨苄 青霉素抗性筛选出阳性克隆进行酶切鉴定, 切出 4 5 3b p片 段 的 为 阳 性 克 隆 子 (F i g1) , 命 名 为 p R S E T - A -f u rA 1,2,3 . 图1 p R S E T - A -F u rA重组质粒酶切鉴定图谱 F i g . 1 R e s t r i c t i o nL a p p i n g o f r e c o n s t r u c t i o np l a s L i dp R S E T - A -F u rA M:D N Am a r k e r;1:p R S E
21、T - A -F u rA 1;2:p R S E T - A -F u rA 2;3:p R S E T - A -F u rA 3 2 . 2 融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化将 p R S E T - A -f u rA转化入E.c o l iB L 2 1,S 0 D S - P S G E 电泳显示有目的蛋白表达。进行可溶性分析发现融 合蛋白有约8 0 %位于菌体蛋白的可溶性上清中, 上 686 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5,2 1(8) 清直接经过镍离子柱进行亲和层
22、析纯化, 得到M r 约为2 3*1 0 3的目的蛋白, 与文献报道一致6 (F i g 2) 。 图2 6 xH i s - F u r A融和蛋白的表达及纯化 F i g . 2 E x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fH i s -F u rAf u s i o np r o - t e i n M:m a r k e r;1:T o t a l p r o t e i n o f n o n - i n d u c e dB L 2 1h a v - i n gp l a s m i dp R S E T - A - f u
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