组织工程支架在脊髓损伤中的应用.pdf
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1、5 4 7 第21卷第5 期 2 008 年5 月 医 学 研 究 生 学 报 J o u r n a l o f M e d i c alP o s t 盯 a d u a t e s Vol. Z INo . 5 M ay. 2 (Xj8 综述 组织工程支架在脊髓损伤中的应用 王北岳综述, 赵建宁审校 南方医科大学南京临床医学院 ( 南京军 区南京 总 医院 ) 骨科, 江苏南京210 002 摘要: 运用组织工程支架修复脊髓损伤的新思路已日 益受到临床重视, 新型材料的出现促进了该领域的快速发 展。目 前应用于脊髓的组织工程支架多采用可降解的天然或合成高分子生物材料, 但它们各有其优缺点
2、。该文作 者对常用的脊髓组织工程支架作一简要综述。 关键词: 组织工程; 支架; 脊髓损伤 中图分类号: R318. 0 8文献标识码: A文章编号: 1 008 一1 99( 2 (X)8)05刁 5 47( 巧 T isS uee n gl n e e ri n g sc a ff0ldsins P in aic o r d inj u 叮 WA N GB e i 一 y u e 卿蜘i ng, Z H A OJ i a n 一 n i n g c h e c k i 咭 ( 刀 印 a “ Inentof口 材 入 印ae d ics, Nanjing sc hoo l ofa in i
3、cal Med icine, 50以 he mM 七 d ic alUn俪rs i t y/ Nanjing 倪nera l HO胡 汉 ofNanjing Milit a ryComm a nd, 尸 M, NanjingZIX X ) 2 , Ji a n 多 , u , Chi na) A bst rac t :The i d e a o f u s i n g t i s s u e e n g i n e e ri n g s c a ffel d s i n th e t re at m e n t ofs p i n a l c o rdi nj u 斗( S C I ) 1 5
4、 d raw i n g m o rea n d m o rec l i n i c alat t e n t i o n , and th e i n t ro d u c t i o n Ofs o m e n e wm a t e ri al s h asp ro m o t e d i t s d e - v e l o p m e n t . Ti s s u e e n gi n e e ri n g sc al fo l d s u s e di nth e t re at m e ntofS C I m a i n l yi n c l u d en a t u reb i o
5、 m a t e ri al and s y n t h e s i z e m a c ro m o l e c ul e b i o mate ri al , e a c h w i thi t s adv a n t a g e s and d i s adv a n t a g e s . Thi s re v i ew fOCu - s e s o n so m e t i s s u e e n g i n e e ri n g sc db 1 d s c o m m o n l y u s e di n S C I . K e y 0 引 w o r ds: T i s s u
6、e e n gi n e e ri n g ; S c aflb l d ; S P i n alc o rdi nj u ry 脊髓损伤平面以下功能恢复是当今医疗上的一 大难题。1 9 8 7 年, 美国国家科学基金会在加利福尼 亚首次提出了“ 组织工程” 一词, 并给予科学定 义川。 组织工程技术的兴起为脊髓损伤的 恢复带 来了新的希望, 而细胞外基质( ex t ra ce U ul arm atrix , E C M ) 支架材料的选择、 构建是组织工程能否成功 的关键, 因而寻找理想的组织工程支架材料是一大 热点。理想的组织工程支架应具备: 良 好的生物 相容性和可降解性, 最好降解
7、时间与神经再生相适 应, 能与周围组织相融, 并支持神经再生及成熟。神 经修复后, 能被机体及时分解、 吸收。提供神经修 复所需的三维空间结构, 即适宜的强度、 硬度、 弹性、 长度和直径, 具有理想的双层空间结构, 可防止瘫痕 形成, 既能保证畅通, 又有接触引导的支架作用。 收稿日 期:2 阅7 折一 5; 修订日 期:2 (X)7 一 1 0 一 12 基金项目:南京军区“ 十一五” 课题基金资助项目 ( 批准号: 肠M All l) 作者简介:王北岳( 1 9 7 8 一 ) , 男, 湖南永州人, 医学硕士, 主治医师, 从事骨科专业。 通讯作者:赵建宁( 1 9 5 7 一 ) ,
8、 男, 江苏南京人, 主任医师, 医 学硕士, 博士研究生导师, 从事骨科专业。 万方数据 5 4 8 医学研究生学报2 008 年5 月第21 卷 应保证神经再生修复所需的营养供应, 导管全长 有足够的神经生长因子。 材料来源广、 易加工, 可 塑形。现用于组织工程支架的材料主要有人工合成 材料( 如脂肪族聚醋、 聚酸醉等) 和天然材料( 如壳 聚糖、 海藻酸盐、 胶原蛋白、 透明质酸、 明胶等) 。随 着组织工程的发展, 不可降解材料的支架已较少应 用, 而生物可降解材料注重细胞与材料间的作用, 在 体内能降解成小分子物质, 可被吸收或经新陈代谢 排泄, 以及具有E C M样特性而成为研究
9、热点。近年 来, 脊髓组织工程支架在临床应用较为广泛。 1 天然物质支架 1 . 1 藻酸盐凝胶( al gi n at e h y d m ge l)藻酸盐是从 海洋生褐藻中 提取的一种线性多糖, 可交联形成网 状藻酸钙离子凝胶, 有良 好的组织相容性和亲水性, 易于渗透扩散营养物质, 可水解, 产物由肾排出, 无 不良 反应, 能为细胞提供三维生长空间。细胞在凝 胶中的生活状态受凝胶的交联密度影响: 交联密度 低, 细胞不易形成立体的生长方式, 负载细胞稀少; 交联的密度过高, 凝胶的网格过小, 细胞拥挤, 影响 营 养 素的 交换和 细 胞生长。 Y u 等 f 】 应用 纤维 模板 与
10、肤修饰技术, 联合趋触性和局部解剖学的导向, 研制成功一种凝胶支架, 有着理想的几何形状, 能 成功地引导细胞勃附和促进原始神经元的轴突生 长 。 P rang 等 制 成以 藻 酸 盐 为 材 料的 高 度 各向 异 性凝胶毛细管, 植人体外轴突和活体大鼠损伤的脊 髓中进行分析, 其在维持本身结构的同时, 也明显诱 导了轴突定向再生, 仅引起轻度的炎性反应。而且 体外试验研究亦表明, 可诱导神经轴突生长并通过 支架, 并能植人成人神经干细胞, 以提升其再生能 力。因而利用藻酸盐水凝胶毛细管诱导损伤脊髓的 神经定向 再生是一个非常有前景的方法。目 前, 藻 酸盐多与其他支架材料结合, 形成复合
11、支架以治疗 脊髓损伤。 1 . 2 胶原( co n ag e n)它广泛存在于动物骨骼及结 缔组织中, 提炼方便, 可被化学修饰、 加工成各种形 态, 具有细胞膜整合素结合区的 R G D 精氨酸 ( A rg ) 一 甘氨酸( Gl y ) 一 天冬氨酸( Asp ) 序列, 易于细 胞勃附, 从而有利于细胞生长、 分化和迁移。同时, 它无抗原性, 生物相容性好, 可降解。现已认为, 它 是神经膜细胞( 又称施万细胞) 分泌的E C M成分之 一, 神经纤维可附 着其上, 从而有利于 再生。已 有学 者将胶原用于修复损伤的脊髓。 Li u 等呜 用胶原制 成导管, 植人动物脊髓半横断的腔隙
12、中, 9 个月后可 观察到动物脊髓损伤处头侧的神经纤维经胶原导管 生长至尾侧。 吴立志等 将胶原或明胶吸附的施 万细胞移植至成年大鼠全横断脊髓的损伤处, 术后 3 个月, 动物后肢自 主运动功能有显著恢复; 大脑感 觉运动区和脑干红核均有被荧光金标记的神经元细 胞体, 提示这2 个区域的神经元轴突能在脊髓内再 生, 并穿越损伤区到达尾侧脊髓。脊髓损伤处有降 钙素基因相关蛋白( C G RP) 和5 一 经色胺( 5 一 H T ) 阳性 神经纤维, 损伤处尾侧也出现5 一 H T阳性神经纤维。 表明胶原或明胶可作为移植细胞的网架, 用于细胞 治疗。但他们发现, 手术植人后3 个月内, 胶原和明
13、 胶并未被完全吸收。 1 . 3 壳聚糖( c hi t os an) 它是一种生物多糖, 由甲 壳素脱乙酞基而制成, 来源广泛。 壳聚糖具有止血、 促进创面愈合、 抑制瘫痕形成, 并有广谱的抑菌作用 及免疫调节作用, 可通过改变壳聚糖的脱乙酞化速 度改变降解速度。它是具有良好的可塑性、 生物相 容性和可降解性的三维多孔支架, 且具有一定力学 强度, 能适应不同部位的组织缺损修复要求。壳聚 糖在体内 可被溶菌酶水解, 机体对其特异的细胞免 疫和 体液免疫的 水平极低。 李晓光等 6 用含生长 因子的生物活性载体的壳聚糖导管作桥梁, 植人大 鼠脊髓半横断模型, 6 一 12个月后, 在含有生物活
14、性 的导管中 脊髓缺损部位神经再生完成, 经过示踪剂 ( 如w G A 一 H RP麦胚凝集素辣根过氧化物酶) 进行 顺行神经束追踪, 发现再生轴突已达到缺损部位远 端, 损伤平面以下脊髓组织中可观察到典型的神经 纤维髓鞘结构和突触。程映华等v将神经干细胞 悬液注人壳聚糖管支架( 每管细胞数约为10 6 个) , 术后2 周, 见移植物内大量吞噬细胞聚集, 支架内新 生血管丰富, 有无髓及有髓神经纤维长入, 术后8 周 可见由神经干细胞分化而来的神经元或神经胶质细 胞成簇状或散在分布于支架中, 并可见再生的神经 纤维, 支架与宿主脊髓两端结合紧密, 无明显界限。 电镜下见较多有髓神经纤维, 髓
15、鞘较厚, 形态规则, 有时也可见正在形成中的新生髓鞘, 散在的未完全 降解的壳聚糖被成纤维细胞及胶原纤维包裹。免疫 组化检查发现, 标记的神经干细胞在移植后能存活, 并分化成神经元、 神经胶质细胞等各种神经组织细 胞, 并且植人的细胞能从两侧残端向脊髓内迁移。 H ua ng等 吕 利 用Ni 一 cr线作 为 轴 柄, 将具有高 渗 透 性、 多孔的壳聚糖制成支架, 在电子显微镜扫描下 观察, 其内 具有平行排列的纵行管样结构。实验证 明, 它能有效地引导脊髓横断后轴突的再生。 1 4 聚舟基T酸醋( 卯l y 一 b 一 h y d ro x y b u t y ra t e , p H
16、B ) P H B 是微生物在不平衡生长条件下贮存于细胞内 万方数据 第5 期王北岳, 等 组织工程支架在脊髓损伤中的应用 5 4 9 的一种天然高分子聚合物, 具有较长的降解周期, 广 泛存在于原核生物中。最早由玩m ni g ne( 19 64年) 从细菌中分离出, 随后在巨杆菌属、 红螺菌属等多种 细菌细胞质颗粒中均有发现, 它具有生物可降解性、 生物相容性、 电压性、 光学活性、 无毒性、 无刺激性、 无免疫原性等性质。在神经组织工程中, P H B 最初 用 来修复周围神经缺损, 2 0 0 2 年, N o v i k o , 等 用 P H B制成支架, 表面覆以藻酸盐凝胶和纤维
17、私连蛋 白, 植入成年大鼠损伤的脊髓内, 8 周后, 未治疗组 约45%红核脊髓束神经元缺失, 移植组神经元缺失 较未治疗组减少一半, 与鞘内 注射脑源性神经营荞 因子( ne u ro t ro p hi c fa ct or , N F ) 或N F 一的效果相似, 而单独植人藻酸盐或纤维私连蛋白或两者结合物者 对神经元存活无明显影响。在PHB支架上加人施 万细胞后, 再生的神经元可从两端长入移植物, 并通 贯全长。 1 . 5 纤维蛋白凝胶( fi b ri n gl ue, F G ) F G是最早使 用的生物材料, 其作为天然E C M成分, 有较好介导 细胞间 信号转导及相互作用的
18、 性能。 Iw ak awa 等 0 用含有 N F的纤维蛋白凝胶植人损伤脊髓的吸收空 洞内, 使腰5 节段残端与凝胶接触, 可明显促进轴突 的 再生。 孟晓梅等 川以纤维蛋白 凝胶包裹嗅鞘细 胞, 植于成年大鼠全横断的脊髓间隙内, 2 周后处死 动物, 发现脊髓两断端连接良 好, 嗅鞘细胞大部分存 活, 并迁移至两侧脊髓实质内, 大量N F 及钙相关蛋 白 4 3 ( C A P 4 3 ) 发生免疫反应, 有神经纤维通过间 隙。 Ta y fo r 等 , 以 纤维 蛋白 凝 胶吸 附 肝素, 然后通 过肝素非共价结合NT一 3 , 制备N T 一 3 缓释系统, 随着 纤维蛋白 凝胶的降
19、解而逐渐释放, 并能通过改变肝 素浓度来调整释放速度, 植人损伤脊髓后第g d , 发 现脊髓神经纤维密度明显增加。但作为生物支架, 其主要缺点是降解速度太快, 不能与神经轴突再生 的时间相匹配。 1 . 6 琼脂糖凝胶支架( ag arosesc a ffol d)天然琼脂 是一种多聚糖, 主要成分为琼脂糖及琼脂胶。琼脂 糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质, 琼脂糖 凝胶可用二相法制得, 其结构均匀, 无毒性, 具有较 大的 空隙, 适合细 胞培养。 st ok ol s 等 ” 用复 合重组 脑源性神经生长因子的多孔冻干琼脂糖支架, 植人 成年大鼠 脊髓损伤模型, 同时设立阴性对照组,
20、1 个 月后, 对支架材料内的神经细胞和轴突的生长情况 进行评价, 结果发现, 支架材料与宿主组织相容性 好, 支 架内 孔隙中 布满宿主 组织, 轴突 在支 架内 呈线 性生长。 复合脑源性神经生长因子 组的 生长速度比 阴 性对照组快, 表明损伤部位的轴突再生能被多孔 冻干琼脂糖支架重塑和诱导。 Ja in等 4 制成一种 包含脑源性神经生长因子的热塑性琼脂糖原位凝胶 支架, 植入成年大鼠脊髓半切损伤处, 发现不仅能促 进轴突长入支架, 而且通过对支架材料一 脊髓界面中 N F 一 1 60阳性神经元、 轴突、 神经胶质酸性蛋白阳性 星形胶质细胞和C S 一 6 阳 性硫酸软骨素的定量分析
21、 发现, 脑源性神经生长因子还可进一步减少机体对 琼脂糖凝胶产生的炎性反应。从而认为, 这种热塑 性支架材料在为神经细胞生长提供三维空间, 复合、 缓释N F , 抵抗损伤部位炎性反应和促进脊髓损伤后 神经再生等方面具有重要潜能。 2 合成可降解支架 随着组织工程的发展, 各种合成的可降解支架 不断涌现, 并且广泛应用于骨、 软骨、 皮肤、 血管等组 织工程中。目 前, 在脊髓损伤中应用较多的主要是 聚经基丁酸类化合物。 2 . 1 聚乳酸 / 聚奔基乙 酸( p o l y l ac t i c ac i d , p LA) P LA 具有良 好的生物相容性, 是可生物降解的高分 子材料。在
22、生理条件下能自 行降解, 其降解速度可 调, 成为最受关注的生物降解高分子材料。Patis t 等【 ” 将 冻 干P LA 与 脑源 性生长因子 结合, 植人胸 髓横断的大鼠 脊髓内, 结果发现组织存活明显增多, 血管生长, 但轴突生长较差。P L A用于临床过程中 发现, 患者出现非特异性无菌性炎性反应率较高。 目 前认为, 这可能由其降解过程中生成的酸性降解 产物引起局部p H值下降所致。研究表明, P LA 的 平均相对分子质量低于200 0 0 时, 无菌性炎症发生 率较高, 使用高分子量的P L A可延迟但不能消除这 一 反应。 H u rt a d o 等 “ 通过对照实验研究,
23、 用包含 施万细胞的纤维蛋白冻干聚乳酸P L A大孔径支架 植入横断的 大鼠 胸髓节段内, 术后1 、 2 和6 周时发 现, 临近支架的脊神经组织中出现活性星形胶质细 胞和硫酸软骨素氨基葡聚糖, 术后 1 周出现支架材 料的血管化, 支架内施万细胞在移植后3d出现部 分细胞调亡, 移植后1 周和更晚的时间点, 支架上出 现移植的施万细胞和带神经微丝的轴突。术后6 周, 支架内 部和表面出现有髓神经轴突, 并长人脊 髓, 明 显改善了 实验动物后肢运动功能。 c al等【 ” 在成年大鼠 胸8 半横断伤中, 植入具有定向通道的 大孔多聚P L A 泡沫支架, 2 周后, 组织学及免疫学检 测证
24、明, 移植支架与宿主脊髓相容良 好, 施万细胞长 人支架通道内, 有大量二眯基苯基叫噪( D A PI) 染色 阳 性细胞, 并在E c M中 观察到浓密的层勃连蛋白 染 色, C A P 4 3 和c G R P 阳 性轴突贯穿管道, 但在急性 万方数据 5 5 0 医学研究生学报2 008 年5 月 第21卷 脊髓损伤模型中, 轴突穿越支架材料界面处存在一 定的阻碍。 尽管如此, 线性泡沫支架在脊髓损伤修 复中 仍有一定的细胞和轴突导向的应用前景。从而 认为, 含施万细胞的纤维蛋白冻干P LA 大孔径支架 及定向通道的大孔多聚P LA 泡沫支架, 能使轴突通 过再生进人和穿越支架, 促进了
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