2011-03-11津田芜菁BrEGL3 cDNA 的克隆及表达分析.pdf
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1、园 艺 学 报 2011,38(3) :487494 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: 收稿日期:收稿日期:20101220;修回日期:修回日期:20110221 基金项目:基金项目:国家自然科学基金重点项目(30730078) ;中央高校基本科研业务费专项(DL09BA09) * 通信作者 Author for correspondence(E-mail:;;Tel:0451-82191783) 津田芜菁 BrEGL3 cDNA 的克隆及表达分析 闫海芳*,李玉花*,孙佰贺,许道琦,聂唯天,刘振华,闵远琴
2、(东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040) 摘 要:摘 要:EGL3(Enhancer of Glabra3)蛋白是一种 bHLH 类蛋白,是一类重要的转录调节因子。为阐 释 BrEGL3 在津田芜菁(Brassica campestris L. ssp. rapiferaTsuda)花青素生物合成中的调控作用, 根据拟南芥 EGL3 基因序列信息设计兼并引物,克隆获得了津田芜菁 EGL3 基因的全长 cDNA 序列, 命名为 BrEGL3,其 GenBank 登录号为 HM208589。序列分析结果显示,BrEGL3 全长 1 794 bp,包含编 码 597 个氨基酸的开放阅读框,
3、分子量约为 66.8 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白含有 DNA 结合域,该 结合属于螺旋环螺旋家族。氨基酸对比分析表明,BrEGL3 与萝卜 EGL3 蛋白相似性最高,其次为拟 南芥中的 EGL3。荧光定量 PCR 检测 BrEGL3 在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合 成的红色芜菁根皮中表达量最高。 关键词:关键词:芜菁;EGL3;基因克隆;表达分析 中图分类号:中图分类号:S 631.3 文献标识码: 文献标识码:A 文章编号: 文章编号:0513-353X(2011)03-0487-08 Cloning and Expression Analysis of Enhanc
4、er of Glabra3(BrEGL3)in Brassica campestris L. ssp. rapiferaTsuda YAN Hai-fang*, LI Yu-hua*, SUN Bai-he, XU Dao-qi, NIE Wei-tian, LIU Zhen-hua, and MIN Yuan-qin (College of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China) Abstract:Enhancer of Glabra3(EGL3)is a bHLH protein that is an
5、 important transcript factor in plant. In order to elucidate the regulation mechanism of EGL3 in Tsuda anthocyanin biosynthesis, cDNA of EGL3 gene was isolated from this plant by the method of RT-PCR using degenerate primers designed according to Arabidopsis EGL3(GenBank accession No. NM202351). Thi
6、s gene was named BrEGL3 (GenBank accession No. HM208589). BrEGL3 was 1 794 bp in full length open reading frame(ORF) encoding 597 amino acids with the molecular weight of 66.8 kD. Software prediction results showed that BrEGL3 contained a DNA helix-loop-helix binding domain. Homology analysis showed
7、 that the deduced amino acid sequence of BrEGL3 shared the highest similarity with Raphanus sativus EGL3 and the lowest similarity with Lotus angustissimus EGL3. Quantitative-PCR analysis showed that the BrEGL3 was the highest expressed in the in red root epidermis of turnip. Key words:Brassica camp
8、estris L. ssp. rapifera;EGL3;gene cloning;expressing analysis EGL3 (Enhancer of Glabra3) 蛋白属于bHLH 类蛋白, 具有典型的螺旋环螺旋 (helixloophelix, 488 园 艺 学 报 38 卷 HLH)结构域,bHLH 转录因子以二聚体形式结合到序列特异 DNA(CANNTG)上,调控基因的表 达(Fan et al.,2004;Lewin,2005) 。 EGL3 在植物体内调控花青素生物合成途径后期基因的表达。花青素合成的直接前体是苯丙氨 酸,依次经过苯丙氨酸脱氨酶(PAL),苯基苯乙烯酮
9、合成酶(CHS),苯基苯乙烯酮黄烷酮异构 酶 (CHI) , 黄烷酮 3羧化酶 (F3H) , 黄烷酮 3, 5羧化酶 (F35H) , 黄烷酮 3羧化酶 (F3H) , 二氢黄烷醇 4还原酶(DFR),花色素合成酶(ANS),花青素还原酶(ANR)等一系列酶的催 化而成的。其中 PAL、CHS、CHI 和 F3H 属于前期基因,DFR、ANS、ANR 等属于后期基因(Holton & Cornish,1995)。而 EGL3 调控其中 DFR 基因的表达调控,过量表达 EGL3 的转基因拟南芥中, 这两个基因的表达都增加了(Nesi et al.,2000)。EGL3 还与其它调控因子 PA
10、P1/2,TTG1 蛋白一 起形成复合体共同调控 DFR 基因的表达调控(Dugassa et al.,2009)。此外 EGL3 还在根细胞生长, 毛状体发育和粘液分泌等途径中发挥功能(Bernhardt et al.,2003,2005)。 在前期研究 UV-A 光诱花青素合成中发现,津田芜菁中存在特殊调节途径特异地调控花青 素的合成,因此 EGL3 作为花青素合成调控因子,克隆该基因和研究该基因的表达特性就尤为重要 (Zhou et al.,2007)。 本研究中根据已经报道的拟南芥序列,设计引物,通过 RT-PCR 扩增克隆获得芜菁 EGL3 基因 cDNA 片段,对该基因在芜菁不同组
11、织中的表达做了分析。 1 材料与方法 1.1 材料处理 以温室中生长至 2 个月的津田芜菁(Brassica campestris L. ssp. rapiferaTsuda)膨大根 的白色根皮、红色根皮、根肉、叶片、花瓣和花蕾为试验材料,放在液氮中速冻后置于80 超低 温冰箱中贮存待用。 取温室中生长至 2 个月的津田芜菁膨大根的白色根皮(1 cm 1 cm) 、红色根皮(1 cm 1 cm) 、与根皮等质量的根肉、叶片、花瓣和花蕾,置于色素提取液(含 1%盐酸的甲醇溶液中,4 放置 24 h(Kawabata et al.,1999)。用紫外分光光度计扫描吸收曲线,测定在 530 nm 具
12、有最高光 吸收值。测定样品在 530 nm 的光吸收,以 OD 值表示花色素苷的含量,色素含量测定生物学重复 3 次。 1.2 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成 以芜菁膨大根的白色根皮、红色根皮、根肉、叶片、花瓣和花蕾为试验材料,采用上海宝生生 物公司的 Trizol 试剂提取该组织总 RNA,进行 RNA 质量和浓度检测后取红色根皮 1 g 的总 RNA 用于 cDNA 第 1 链的合成。 1.3 BrEGL3 的 cDNA 克隆与序列测定 参照TaKaRa公司的RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒说明书合成cDNA第1链。 以拟南芥EGL3 基因 (GenBan
13、k accession No. NM202351) 核酸序列为参考设计完整cDNA序列PCR引物: BrEGL3-F: 5-CATTATAGAAGAAACAATG-3,BrEGL3-R:5-TATAAACCTTGAATCCTTA-3,用cDNA第一 链为模板。 PCR条件为:94 3 min 预变性,94 30 s,52 30 s,72 90 s,35个扩增循环,最后72 延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测、回收目的条带,与pGEM-T载体(TIANGENE) 3 期 闫海芳等:津田芜菁 BrEGL3 cDNA 的克隆及表达分析 489 连接,16 过夜。连接产物转化到大肠杆
14、菌TOP10,在X-gal/ IPTG琼脂糖平板上挑选白色克隆,由 宝生物(大连)有限公司完成序列测定。测序引物分别为:pGEM-T载体引物T7,SP6,再设计引物 F:5-AGCTCCTCATGGAACTTTA-3,R:5-TTTCATCTCCAACCTTAT-3,完成全长测序。 1.4 芜菁 BrEGL3 基因生物信息学分析采用的方法 BrTTG1基因生物信息学分析采用下列方法: (1)BrTTG1基因序列同源性比对由NCBI的 nucleotide BLAST程序进行(http:/www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)。(2)BrTTG1保守性功能域分 析由NC
15、BI的protein BLAST程序进行(http:/www. ncbi. Nlm. nih. gov/blast/)。(3)氨基酸的多序 列比较用Clustalx进行,并用BOXSHADE软件进行处理,保守位点参考(2)中的功能域列表(http: /www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/cddsrv. cgi) 。 (4)进化树的构建由DNAMAN-Tree View 程序 完成。 1.5 芜菁 BrEGL3 在芜菁不同组织中的表达 用 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems,美国)检测 BrEGL3
16、基因在芜菁膨大根的 白色根皮、红色根皮、根肉、叶片、花瓣和花蕾的表达。 BrEGL3 引物为:BrEGL3-F,5-CTCAGACGTTTGTTGGAGCA-3;BrEGL3-R,5-CGAGATC ACGCCTTGGTAAT-3。 内标 BrACTIN 引物为: BrACTIN-F, 5-GCTCAGTCCAAGAGAGGTATTC-3; BrACTIN-R,5-GCTCGTTGTAGAAAGTGTGATC-3。所用的试剂为 SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa,日本)。 10 L 反应体系中包括 5 L SYBR Premix Ex TaqTM,0.2 L ROX Re
17、ference Dye(50 ) (TaKaRa,日本),4.5 L ddH2O(TIANGEN,中国),1/6 L cDNA,1/3 L 引物混合物(正向 引物和反向引物,10 mol L-1)。 采用的 Real-Time PCR 程序如下:95 30 s 预变性,40 个扩增循环(95 10 s,60 31 s), 最后是一个从 60 加热到 90 的溶解过程。以 BrActin 的转录表达水平为内参,目的基因相对转 录表达水平的计算参照 Bogs 等(2005)的方法,公式为 2- Ct ,Ct = Ct(目的基因)- Ct(Actin)。 每个样品设 3 个生物学重复试验。 2 结果
18、与分析 2.1 芜菁 BrEGL3 基因的 cDNA 克隆及序列分析 以拟南芥基因 EGL3 序列为参考紧邻起始密码和终止密码设计引物,得到了芜菁 BrEGL3 基因 的 cDNA 序列(图 1)。 该基因全长 1 794 bp,编码 597 个氨基酸的开放阅读框,分子量约为 66.8 kD。 氨基酸结构分析显示该蛋白约 403 459 处含有 DNA 结合域, 该结合域属于螺旋环螺旋家 族(结果未显示) 。 螺旋环螺旋结构域的特征是含有 DNA 结合域,E-box/N-box 特异性位点,二聚体作用面 3 个保守区:其中的 DNA 结合域决定了该转录因子的特异性,即能够特异地调控哪些基因的表
19、达; Glu 负责与 E-box(CANNTG)结合,Pro 负责与 N-box(CACGC/AG)结合;二聚体作用面则在二 聚化中起作用。对于 BrEGL3 而言,氨基酸序列比较,保守性分析结果(图 2)显示:特点 1 中标* 的氨基酸为 DNA 结合区,特点 2 中标*的氨基酸 E 与 E-box(CANNTG)结合,特点 3 中标*的氨 基酸则在转录因子二聚化中起作用。 490 园 艺 学 报 38 卷 图图 1 芜菁芜菁 BrEGL3 cDNA 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列核苷酸序列及其推导的氨基酸序列 Fig. 1 cDNA and deduced protein sequence
20、 of BrEGL3 fromTsuda 3 期 闫海芳等:津田芜菁 BrEGL3 cDNA 的克隆及表达分析 491 图图 2 芜菁芜菁 BrEGL3 与其他已知与其他已知 EGL3 基因氨基酸序列相似性比较基因氨基酸序列相似性比较 相同的氨基酸残基用黑色阴影显示,保守位点用灰色阴影显示,不同的氨基酸以白色表示;上述序列分别来自芜菁 BrEGL3(HM208589) , 萝卜 RsEGL3(AAD03489) ,盐芥 ThEGL3(BAJ34303.1) ,拟南芥 AtEGL3(NP_176552.1) ,陆地棉 GhEGL3(AAK19613.1) ,尖齿百脉 根 LaEGL3(ABM69
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