BE表达载体构建及TEV蛋白酶突变体的功能分析.pdf
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1、独创性:声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其它 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名:时间: 沙厶年多月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在
2、不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名: 第一导师签名: 时间: 厶年厂月f 日 时间: 如厶年f 月日 摘要 m l l l l l l l l m l l l l l 洲洲1 1 l l l 1 1 I l I Y 17 3 5 10 5 外源蛋白在大肠杆菌中重组表达时,常常会错误折叠或形成无功能的包涵 体。有多种方法能用于改善外源蛋白的重组表达,最常用方法是与分子伴侣共表 达或融合表达,但是后者需要高效的蛋白水解酶切除融合表达的分子伴侣。本研 究,构建了含有多个大肠杆菌分子伴侣的辅助表达载体,分析了它们的功能;利 用定点突变
3、技术获得T E V 蛋白酶( t o b a c c oe t c hv i r u sp r o t e a s e ) 突变体,并分析了体 内和体外的活性,获得以下结果: 1 克隆分子伴侣编码基因。克隆大肠杆菌分子伴侣基因d n a K 、d n a J , g r p E 、 g r o E L 、g r o E S 和c l p B ,测序结果表明克隆出的基因片段与G e n B a n k 公布的序列一 致。 2 构建分子伴侣表达载体。分别将分子伴侣基因插入p R S F D u e t 1 和 p C D F D u e t 1 两个表达载体,构建成载体p R G E S P (
4、含g r o E L 、g r o E S 和g r p E ) 和 p C D J C L ( 含d n a K 、d n 甜和c 伽) 。 3 转化大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) ,诱导表达,S D S P A G E 分析结果显示:g r o E L , g r o E S ,g r p E ,d n 水a n dc l p B 诱导表达的条带明显,但是未检测到d n a J 的表达条 带。 4 分析分子伴侣表达载体的效应。共表达结果显示,分子伴侣促进玉米西罗 叶绿三酸:铁螯合酶和谷氨酸1 半醛氨基转移酶的可溶性表达,但是对玉米尿卟 啉原I I I 脱羧酶的可溶性表达没有明显
5、促进作用。 5 改造T E V 蛋白酶。以T E V 蛋白酶$ 2 1 9 V 为原始体,定点突变疏水性氨基酸 残基,获得两种T E V 蛋白酶突变体( T E V Qp r o t e a s e ,T E V rp r o t e a s e ) 。S D S P A G E 显 示T E V 蛋白酶突变体的可溶性表达水平在重组大肠杆菌中有明显提高,每升菌液 纯化获得约1 6 5m g 的重组T E V Q 蛋白酶,1 0 8m g 的T E V F 蛋白酶,明显高于报道的 野生型T E V 蛋白酶。 6 分析了T E V 蛋白酶的活体和离体活性。T E V 蛋白酶与含有T E V 酶切位
6、点的 融合蛋白共表达,电泳显示能有效切割融合蛋白,利用纯化的T E V 酶,消化纯化 的含有T E V 蛋白酶酶切位点的融合蛋白,电泳显示它能有效切割靶蛋白,T E V Q 蛋白酶的活性明显高于T E V F 蛋白酶。 综上所述,本文构建了两个分子伴侣辅助表达载体并分析了它们的表达水 平。研究结果显示分子伴侣对改善不同外源蛋白可溶性表达的效率不同,与靶蛋 白的内在性质有关;获得的T E v 蛋白酶突变体,与报道的野生型相比,表达量得 到很大提升,在体内和体外都具有较高的活性,为T E V 蛋白酶在蛋白的可溶性表 达及蛋白标签的应用奠定基础。 关键词:分子伴侣,T E v 蛋白酶,定点突变,大肠
7、杆菌 A b s t r a c t E s c h e r i c h i ac o l ii st h em o s te x t e n s i v e l yu s e dh o s tf o rp r o d u c t i o no fh o m o l o g o u s p r o t e i n s H o w e v e r ,t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n si nEc o l io f t e nf a i lt op r o p e r l yf o l da n d o v e r e x p r e s s e da
8、 si n c l u s i o nb o d i e s T h es e v e r a lc h a p e r o n e sw e r ed e t e r m i n e dt oh e l p t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sf o l d i n gi n d e p e n d e n t l yo ra st h ef u s i o nt a ga tNt e r m i n u s R e m o v a lo ft h et a gr e q u i r e st h eh i g he f f i c i e n
9、ts p e c i f i cp r o t e i n a s e I nt h i ss t u d y , w e c o n s t r u c t e dt w oh e l p e rv e c t o r se x p r e s s i n gs i xc h a p e r o n eg e n e su n d e rT 7p r o m o t e ra n d a n a l y z e dt h ee f f e c t so ns o l u b l ee x p r e s s i o no ft h r e em a i z ep r o t e i n s
10、W em u t a t e dT E V p r o t e a s eb a s e do nt h es t r u c t u r ea n dc h a r a c t e r i z e dt h i sm u t a n t T h em a i nr e s u l t sa r e l i s t e da sb e l o w : 1 S i xc h a p e r o n eg e n e sw e r ea m p l i f i e db yP C R u s i n gE s c h e r i c h i ac o l iD H 5 a g e n o m i
11、cD N Aa st h et e m p l a t e A l lP C Rp r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e db yt h es e q u e n t i a l a n a l y s i s 2 S i xc h a p e r o n eg e n e sd i g e s t e dw i t ht w or e s t r i c t i v ee n z y m e sw e r ei n s e r t e d s e q u e n t i a l l yi n t ot h ee x p r e s s i o nv e
12、c t o rp R S F D u e t - 1a n dp C D F D u e t - 1t r e a t e dw i t ht h e s a m em a n n e rt og e n e r a t et h er e s u l t a n tp l a s m i d ,n a m e dp R - G E S Pw i t hg r o E L ,g r o E S a n d g r p Eg e n e a n dp C D J C Lw i t hd n a K , 幽“a n dc l p Bg e n e 3 T h eS D S - P A G Ea n
13、 a l y s i sf r o mt h ei n d u c e dc r u d ee x t r a c ts h o w e dt h a tg r o E L , g r o E S ,g r p Ed n a K , a n dc l p Bw e r ee x p r e s s e do b v i o u s l y ,b u tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f d n a JW a sn o to b s e r v e dc l e a r l y 4 C o - o v e r e x p r e s s i o nc h a
14、 p e r o n e s i nEc o l ii m p r o v e dt h es o l u b i l i t yo ft h e r e c o m b i n a n tm a i z es i r o h y d r o c h l o r i nf e r r o c h e l a t a s e ,a n dp a r t l yi m p r o v e dt h ef o l d i n g o ft h er e c o m b i n a n tm a i z eg l u t a m a t es e m i a d h y d ea m i n o t
15、r a n s f e r a s e ,b u th a sn o te f f e c t o nt h e f o l d i n g o ft h er e c o m b i n a n tm a i z eu r o p o r p h y r i n o g e nI I I d e c a r b o x y l a s e o b v i o u s l y , a ss h o w nb yS D S - P A G E 5 U s i n gt h eT E Vp r o t e a s e $ 2 19 Va st h em o d e l ,t h en e wm u
16、 t a n tn a m e dT E V F a n dT E V Qw e r ec r e a t e du s i n gs i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s T h ep r o d u c t i o n o ft h e p u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nW a su pt o10 8m g Lf o rT E V Fa n d16 5m g Lf o rT E V Q 6 T h eT E V Qm u t a n tp r o t e a s ea c t
17、i v i t yi sm o r et h a nT E V Qu s i n gt h ep u r i f i e d r e c o m b i n a n tG S Tf u s i o nw i t h i nT E V p r o t e a s ec l e a v a g es i t ea st h es u b s t r a t e a ss h o w n b yS D S P A G E T h ee f f i c i e n tc l e a v a g ei nv i v oo fG S Tf u s i o nb yc o e x p r e s s i o
18、 nT E V Q m u t a n tp r o t e a s eW a sa l s od e t e c t e d I nc o n c l u s i o n ,w ec o n s t r u c t e dt w oh e l p e rc o e x p r e s s i o nv e c t o r sa n da n a l y z e d m o l e c u l a rc h a p e r o n e se x p r e s s i o nl e v e l T h ee f f e c to fb o t hh e l p e rv e c t o r s
19、o nt h e e n h a n c e m e n to ft h es o l u b i l i t yo ft h r e em a i z ee n z y m e si n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i so f t e t r a p y r r o l e si nE c o i li sd e p e n d e n to ft h ei n t r i n s i cf o l d i n gc h a r a c t e ro ft h ee n z y m e T h eh i g hs o l u b l eT
20、E V p r o t e a s em u t a n tw i t ht h ei n c r e a s e da c t i v i t yw a so b t a i n e da n d p r o v i d e dap l a t f o r mf o rt h e u s eo fv a r i o u sf u s i o nt a g si np r o t e i ne x p r e s s i o n K e y w o r d s :E s c h e r i c h i ac o l i ,m o l e c u l a rc h a p e r o n e s
21、 ,h e l p e rv e c t o r s ,T E Vp r o t e a s e , m u t a t i o n 目录 文献综述1 弓I 言6 1 本课题的研究意义6 2 本研究的内容、目标7 2 1 研究内容7 2 2 研究目标7 材料与方法8 1 材料8 1 1 质粒、菌株和试剂。8 1 2 仪器8 2 方法8 2 1 大肠杆菌分子伴侣辅助表达载体构建8 2 1 1 引物设计8 2 1 2 分子伴侣基因扩增9 2 1 3 分子伴侣表达载体构建9 2 1 4 重组分子伴侣蛋白的表达检测1 0 2 1 5 分子伴侣表达载体的效应检测1 0 2 1 6 蛋白分析1 0 2 2
22、T E V 蛋白酶突变体构建1 0 2 2 1 利用定点突变得到T E V 蛋白酶突变体及序列比对1 0 2 2 2T E V Q 蛋白酶与T E V F 蛋白酶可溶性及表达量比较1 0 2 2 3T E V o 蛋白酶突变体体内体外酶切1 1 2 2 4T E V o 蛋白酶突变体与T E V F 蛋白酶酶活性比较1 2 结果与分析1 3 1 大肠杆菌分子伴侣辅助表达载体构建。1 3 1 1 分子伴侣基因克隆1 3 1 2 分子伴侣表达载体构建1 3 1 3 分子伴侣基因表达1 4 1 4 分子伴侣辅助载体对玉米四吡咯分子合成的3 个酶表达的作用1 5 2T E V 蛋白酶突变体构建1 7
23、2 1 利用定点突变得到T E V 蛋白酶突变体及序列比对1 7 2 2T E V Q 蛋白酶突变体与T E V F 蛋白酶可溶性比较l7 2 3T E V Q 蛋白酶突变体体内体外酶切1 8 2 4T E v Q 蛋白酶突变体与T E V F 蛋白酶酶活性比较18 讨论19 结论2 2 参考文献2 3 致谢3 3 作者简介3 4 文献综述 蛋白重组技术是目前研究蛋白质结构和功能的重要手段,被广泛应用于生物 及医学领域【l 】。已有多种表达系统用于获得重组蛋白,如大肠杆菌表达系统、酵 母表达系统、昆虫表达系统、无细胞表达系统等系统。其中,大肠杆菌由于生长 速度快,培养简单,价格低廉,遗传背景清
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- BE 表达 载体 构建 TEV 蛋白酶 突变体 功能分析
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