GBT 14924.11-2001.pdf
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1、G B / T 1 4 9 2 4 . 1 1 一2 0 0 1 前言 本标准的全部技术内容为推荐性的。 本标准从G B 1 4 9 2 4 - - 1 9 9 4 实验动物全价营养饲料 中分离出来, 形成独立的标准。 本标准中所列两种方法具有同等效力。 本标准及其配套标准自 实施之日 起, 代替G B 1 4 9 2 4 -1 9 9 4 , 本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。 本标准起草单位: 中国实验动物学会。 本标准主要起草人: 周瑞华、 王竹、 石磊、 王光亚、 张瑜、 郑陶、 刘秀梅。 本标准由国家科学技术部委托技术归口 单位中国实验动物学会负责解释。 本标准于1 9 9
2、 4 年1 月首次发布。 中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 实验动物配合饲料 维生素的测定 G B / T 1 4 9 2 41 1 - - 2 0 0 1 L a b o r a t o r y a n i ma l s -F o r mu l a f e e d s 代替 G B 1 4 9 2 4 1 9 9 1 - De t e r mi n a t i o n o f v i t a mi n s 范 围 本标准规定了实验动物配合饲料中维生素的测定方法, 即配合饲料中维生素A、 维生素E , B , 、 维生素B , D 、 的侧定方法 烟酸、 维生素 B fi 、 总抗坏血
3、酸、 总胆碱、 叶酸、 维生素 B , 、 维生素 K3 、 泛酸、 生物素、 维生素 维生素 本标准适用于实验动物小鼠、 大鼠、 兔、 豚鼠、 地鼠、 犬和猴的配合饲料及其原料的测定。 2 引用标准 下列标准所包含的条文, 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时, 所示版本均 为有效。所有标准都会被修订, 使用本标准时的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。 G B / T 1 2 3 8 8 -1 9 9 。 食物中维生素A和维生素E的测定方法 G B / T 1 2 3 9 0 -1 9 9 。 食物中硫胺素( 维生素B , ) 的测定方法 G B / T 1 2 3
4、9 1 -1 9 9 0 食物中核黄素的测定方法 G B / T 1 2 3 9 2 -1 9 9 0 蔬菜、 水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法荧光法和2 , 4 一 二硝基苯胺法 G B / T 1 2 3 9 5 -1 9 9 0 食物中烟酸的测定方法 G B / T 1 4 7 0 0 -1 9 9 3 饲料中维生素B , 测定方法 G B / T 1 4 7 0 1 -1 9 9 3 饲料中维生素B z 测定方法 G B / T 1 7 4 0 7 -1 9 9 8 食物中 维生素B 。 的测定 G B / T 1 7 8 1 2 -1 9 9 9 饲料中维生素E的测定高效液相色谱法
5、 G B / T 1 7 8 1 6 -1 9 9 9 饲料中总抗坏血酸的测定邻苯二胺荧光法 G B / T 1 7 8 1 7 -1 9 9 9 饲料中维生素A的测定高效液相色谱法 G 1 3 / T 1 7 8 1 8 -1 9 9 9 饲料中维生素D : 的测定高效液相色谱法 3 测定方法 11 配合饲料中维生素A和维生素E的测定 按G B / T 1 2 3 8 8 , G B / T 1 7 8 1 2 , G B / T 1 7 8 1 7 的规定执行 3 . 2 配合饲料中维生素B : 的测定 按G B / T 1 4 7 0 0 , G B / T 1 2 3 9 0 的规定执
6、行。 13 配合饲料中维生素B : 的测定 按G B / T 1 2 3 9 1 , G B / T 1 4 7 0 1 的规定执行。 中华人民共和国国家质It监督检验检疫总局2 0 0 1 - 0 8 - 2 9 批准 2 0 0 2 - 0 5 - 0 1实施 G B / T 1 4 9 2 41 1 2 0 0 1 34 酉 己 合饲料中烟酸的测定 按G B / T 1 2 3 9 5 规定执行 35 配合饲料中维生素B 。 的测定 按( = B / r 1 7 3 0 7 规定执行。 I6 配合饲料中总杭坏血酸的测定 按G B / r 1 2 3 9 2 , G B / T 1 7 8
7、 1 6 规定执行 I了 配合饲料中总胆碱的测定 3 . 7 . 1 原理 配合饲料中的胆碱经过碱处理提取后, 通过硅镁吸附3i (J 柱色谱纯化. 然后用雷纳克盐( r e i n e c k a t e ) I胆碱反应生成粉红色的胆碱一 雷纳克盐复合物。此复合物被丙酮洗脱后, 在 5 2 6 n m有最大吸收 其吸 收伎与胆碱浓度成正比。本方法检出限为。 . 1 m g 3了 . 2 试剂 所有试剂均为分析纯, 实验用水为蒸馏水。 17 . 2 . 1 甲醇 3 . 7 - 2 . 2 三氯甲烷。 3 . 7 - 2 . 3 乙酸甲醋。 17 . 2 . 4 丙酮。 I了 . 2 . 5
8、1 0 %丙酮 取 1 0 m l , 丙酮与9 0 m l , 水混合。 17 . 2 . 6 冰乙酸。 3 . 7 - 2 . 了 冰乙酸一 甲醇溶液: 取 l o m 工冰乙酸和9 0 m l甲醇混合。 3 . 7 . 2 . 8 氢氧化钡。 3 - 7 . 29 硅镁吸附剂( F l o r i s i l ) : 6 0 - 1 0 0 目。 17 . 2 . 1 0 提取液: 于1 0 0 m l甲醇中加人4 -5 g 无水氢氧化钡, 搅拌1 0 m i n 再加人l o m 工只氯甲烷 混合 过滤去除多余的氢氧化钡。 3 . 7 - 2 . 1 1 雷纳克馁盐( a m m o
9、n i u m r e i n e c k a t e ) 饱和溶液: 称取2 3 g 雷纳克钱盐, 加人 l o o m l 水, 搅 拌 1 0 m i n , 过滤去除多余的雷纳克钱盐。实验当日 配制。 17 . 2 . 1 2 胆碱标准贮备液( 5 m g / m L ) : 准确称取无水氯化胆碱0 . 5 7 61 g . 溶解于水中. 并定容至 1 0 0 m l 。冰箱保存。 3 . 7 - 2 . 1 3 胆碱标准应用液( 1 . 0 m g / m L ) : 准确吸取2 0 . 0 m 工标准贮备液, 用水稀释并定容至1 0 0 m 工 J 17 . 3 仪器与设备 3 .
10、 7 . 3 . 1 实验室常用设备。 3 . 7 . 3 . 2 回流提取装置。 3 . 7 . 3 . 3 色谱柱: 0 . 8 c m( 内径) X 3 0 c m的玻璃柱, 柱上端为容积 3 0 -5 0 m L的储液杯, 底端收缩变 细, 并装有活塞活塞上约 1 c m处有一玻璃筛板, 筛板孔径为 1 6 3 0 p m。使用前需干燥 3 . 7 - 3 . 4 分光光度计 3 - 7 . 4 测定步骤 3 . 7 . 41 提取 称取适量样品( 约含 5 5 0 m g胆碱) , 置干 1 0 0 m L具塞锥型瓶中, 加人4 0 m l提取液、 于7 6 - 8 2 C 恒温水浴
11、回流 3h , 回流速度为每秒 1 -2 滴。冷却, 样品过滤至 1 0 0 m 容量瓶中, 反复用 5 - 1 0 mI . 冰乙酸一 甲醇溶液洗涤锥形瓶和滤渣, 洗液并人容量瓶中, 用冰乙酸调节p H至 2 -6 , 用甲醇定容 至刻度 3 . 7 . 4 . 2 纯化 3 . 7 . 4 . 2 门填装色谱柱: 将干燥的硅镁吸附剂约4 g 浸人甲醇中, 取干燥色谱柱, 湿法将硅镁吸附剂填 G s / T 1 4 9 2 4 , 1 1 - - 2 0 0 1 充人色潜柱中, 至硅镁吸附剂的高度达 1 0 c m左右。用甲醇冲洗色谱柱 并保持甲醇液面高于硅镁吸附 4 1 1 -2 c m,
12、 直至使用为止 3 . 7 . 4 . 2 . 2 柱色谱纯化: 吸取 5 0 m工的提取液, 加到已填装好的色谱柱中, 打开底端活塞, 使提取液靠 重力作用流过色谱柱 立即依次用5 , 1 0 m L甲醇, 2 份1 0 m l乙酸甲醋和1 0 m 1 . 1 0 %丙酮洗涤色谱柱 接着加人5 mL雷纳克钱盐饱和溶液通过色谱柱, 用 2 份 1 0 m l冰乙酸洗涤, 直至流出液清亮为止。少 月 1 5 m l丙酮洗脱色谱柱上胆碱一 雷纳克盐复合物的粉红色色谱带, 用 2 5 m l - 具塞量筒收集全部洗脱液 并用丙酮定容至1 5 m 工 。 3 . 了4 . 3 比色测定: 用分光光度计
13、, 于 5 2 6 n m波长下。 以丙酮调节零点、 测定样品吸光度值, 在标币工 作曲线上查出胆碱含量, 或用回归方程计算出相应的胆碱含量, 求得计算结果。 3 . 7 - 4 . 4 标准工作曲线: 分别吸取 0 . 5 0 , 1 . 0 , 2 . 0 , 3 . 0 , 4 . 0 , 5 . 0 mL标准应用液, 相当于胆碱含量 0 . 5 , 1 . 0 , 2 . 0 , 3 . 0 , 4 . 0 , 5 . 0 m g , 按照上述样品测定步骤操作。 以 胆碱含量做横坐标, 以吸光度值为纵坐标绘 制标准工作曲线, 并计算回归方程。 I7 . 5 计算结果 见式( 1 ) e
14、 c xm x V , V x 1 0 0 . . . . . . . . . . . . . , (1) 式中: X- 一 样品中胆碱的含量, m g / 1 0 0 g ; 。 从标准回归曲线上查得的胆碱含量, m g ; V样品提取液定容体积, mL ; V z 一 纯化用提取液的体积, mL ; M - 样品质量, 9 。 I了6 结果的允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值 S _ 0) 。 3 . 92 . 5 抗坏血酸( 生化试剂) 。 39 . 2 . 6 无水葡萄糖。 19 . 2 . 7 无水乙酸钠。 19 . 2 . 8 L胧氨酸( 生化试剂) 。 19
15、 - 2 - 9 D, I , 色氨酸( 生化试剂) 19 . 2 . 1 0 1 0 m o t / I氢氧化钠溶液: 称取 2 0 0 g氢氧化钠溶于适量水中. 定容至5 0 0 m l 3 . 9 . 2 . 1 1 (1+4 ) 乙醇溶液: 2 0 0 m 工无水乙醇与8 0 0 m l水充分混匀 19 . 2 . 1 2 酸解酪蛋白 称取5 0 g 不含维生素的酪蛋自于5 0 0 m L 烧杯中 加2 0 0 m 工 3 m o t / l . 盐酸, 经 1 2 1 ( , 6 压水解 6h 。 将水解物转移至蒸发皿内, 在沸水浴 L 蒸发至膏状。 加2 0 0 ml水使之溶解后再
16、蒸 发至膏状, 如此反复3 次, 以去除盐酸以嗅酚蓝作外指示剂 用 1 0 M O O 氢氧化钠溶液调节p H至 3 . 5 加2 0 g 活性炭, 振摇, 过滤, 如果滤液不呈淡黄色或无色, 可 用活性炭重复处理。滤液加水稀释至 5 0 0 m l , 液面上加少许甲苯于冰箱中保存。( 该试剂也可从 D f i c o 公司购得, 产品号为N o . 0 2 8 8 - 1 5 - 6 0 ) 19 . 2 . 1 3 腺M吟、 鸟嗓吟、 尿嗜咙溶液: 称取硫酸腺嗦吟( 纯度为 9 8 %) 、 盐酸鸟嗦吟( 生化试剂) 以及 尿嗜吮各。 . 1 g 于2 5 0 m l烧杯中. 加7 5
17、m L水和2 m l 浓盐酸, 然后加热使其完全溶解, 冷却 若有沉 淀产生, 加盐酸数滴, 再加热, 反复至冷却后无沉淀产生为止, 用水稀释至1 0 0 m l 。 液面上加少许甲苯- I - 冰箱中保存 3 . 9 - 2 . 1 4 维生素溶液 I : 称取2 5 m g 核黄素. 2 5 m g 盐酸硫胺素, 。2 5 m g 生物素, 5 0 m g 尼克酸, 用 0 . 0 2 m o l / I 、 乙酸溶液溶解并定容至 1 0 0 0 mL , 39 . 2 . 1 5 维生素溶液 u : 将 5 0 m g对氨基苯甲酸, 2 5 m g泛酸钙, 1 0 0 m g 盐酸毗哆醉
18、, 1 0 0 m g 盐酸毗 哆醛. 2 0 m g 盐酸毗哆胺, 5 m g 叶酸溶于( 1 +4 ) 乙醇溶液. 并定容至1 0 0 0 m l - 19 . 2 . 1 6 甲 盐溶液: 称取2 5 g 磷酸二氢钾、 2 5 g 磷酸氢二钾溶于5 0 0 m l水中, 加5 滴浓盐酸, 混匀 19 . 2 . 1 7 乙盐溶液: 称取 1 0 g硫酸镁( Mg S O , “ 7 H 2 ( ) ) 1 0 . 5 g氯化钠、 0 . 5 g硫酸锰( Mn S O , 4 H , ( ) ) , 0 . 5 g 硫酸亚铁( F e S O 7 H , 0 ) 溶于水并定容至5 0 0
19、m L , 加5 滴浓盐酸, 混匀 19 . 2 . 1 8 黄嗓吟溶液: 称取1 . 0 g 黄嚓吟溶于2 0 0 m 工 一 水中, 7 0 C 加热条件下, 加入3 0 m l , 氢氧化馁 ( N 氏O H) ( 2 +3 ) , 搅拌直至固体全部溶解, 冷却后用水定容至 1 0 0 0 M I 3 . 9 . 2 门9 天冬酞胺溶液: 称取1 . 0 g L 一 天冬酞胺溶于水中, 并定容至1 0 0 m 工 19 . 2 . 2 0 吐1 1 - 8 0 溶液: 将2 5 g 吐温一 8 0 溶于乙醇并定容至2 5 0 m l 19 . 2 . 2 1 维生素B , 标准溶液( 均
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