GBT 14929.5-1994.pdf
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1、中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌 烯醇的测定方法 G B / T 1 4 9 2 9 . 5 一 9 4 Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f d e o x y n i v a l e n o l i n c e r e a l a n d c e r e a l p r o d u c t s 1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物及其制品( 蛋糕、 饼千、 面包等) 中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫 测定法( E L I S A ) 的基本要求。 本标准适用于谷物( d 、 米、 玉米
2、、 大麦等) 及其制品 蛋糕、 饼干、 面包等) 中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测 定。 第一 法的最低 检出 浓度为0 . 1 m g / k g , 第二法的最低检出浓度为。1 n g / k g , 第一篇薄层色谱测定法 2 原理 谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、 净化、 浓缩和硅胶G薄层展开后, 加热薄层板。由 于在制备薄层板时加入了三氯化铝, 使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在3 6 5 n m紫外光灯下显蓝色荧光, 与标准 比较。 3 试剂 以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂, 水为蒸馏水或同等纯度的水。 三氯甲烷 。 无水乙醇。 甲醇。 石油醚( 6 0 _9 0 C 或3 0 - 6 0
3、 C ) . 乙酸乙醋。 乙睛。 丙酮。 异丙醇。 乙醚。 无水乙醚。 氯化铝( A I C I _, 6 H, O) : 化学纯。 JI门1,J月勺反J六匕7子OU八廿 :可.可. 勺Jq曰,JqJ恤JIJ寸Jl口,J 中性氧化铝: 层析用, 经 3 0 0 C 活化4 h , 置千燥器中备用。 活性炭: 2 0 g活性炭, 用 3 m o t / L盐酸溶液浸泡过夜、 抽滤后, 用热蒸馏水洗至无氯离子, 在 310洲312313 中华人民共和国卫生部 1 9 9 4 一 0 1 一 2 4 批准1 9 9 4 一 0 8 一 0 1 实施 G B / T 1 4 9 2 9 . 5 一 9
4、 4 1 2 0 C 烘干备用。 3 门4 硅胶 ( s薄层层析用。 3 . 1 5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇( 以下简称D O N ) 标准溶液, 精密称取5 . 0 m g D O N, 加乙酸乙酷一 甲 醇( 1 9 : 1 ) 溶解。转入1 0 m L容量瓶中, 用乙酸乙醋一 甲 醇( 1 9 : 1 ) 稀释至刻度, 此标准溶液含D O N O . 5 m g / m l 。吸 取此标准溶液。 . 5 m L , 用乙酸乙醋一 甲醇( 1 9 : 1 ) 稀释至1 0 m L , 此溶液每毫升含D O N 2 5 p g , 4 仪器 4 . 1 小型粉碎机。 4 . 2 电动振荡器。 4
5、 . 3 7 5 m L玻璃蒸发皿。 4 . 4 层析柱: 内径2 c m, 长 1 0 c m, 不具活塞 4 . 5 1 0 mL具塞浓缩瓶: 底部具0 . 2 mL刻度尾管。 4 . 6 玻璃板: 5 X 2 0 c m , 4 . 7 薄层涂布器: 。 . 3 m m 4 . 8 展开槽: N长2 5 c m, 宽6 c m, 高4 c m, 4 . 9 紫外光灯: 3 6 5 n m, 4 . 1 0 微量注射器: 1 0 , L , 5 0 p L , 4 . 1 1 5 0 m l平底管。 4 . 1 2 双波长薄层扫描仪: 带数据处理机。 5 分析步蕊 5 门提取 称取2 0
6、g 粉碎样品置于2 0 0 m L 具塞锥瓶中, 加8 m L水和1 0 0 m L 三氯甲 烷一 无水乙醇( 8 : 2 ) , 密 塞。 在瓶塞上徐层水, 盖严防漏, 振荡1 h , 通过折叠快速定性滤纸过滤, 取2 5 m L滤液于7 5 m l _ 玻璃蒸 发皿中, 置 9 0 C水浴上通风挥干。 5 . 2 净化 5 . 2 . 1 液一 液分配 5 . 2 . 1 . 1 谷物: 用5 0 m l , 石油醚分次溶解燕发皿中的残渣, 洗入1 0 0 m L分液漏斗中, 再用2 0 m L ( 玉 米样品用3 0 m L ) 甲醇一 水( 4 : 1 ) 分次洗涤蒸发皿, 转人同一分
7、液漏斗中。 52 . 1 . 2 谷物制品( 蛋糕、 饼干、 面包等) : 用1 0 0 m L石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣, 洗入2 5 0 m L分 液漏斗中, 再用3 0 m L甲醉一 水( 4 c ”分次洗涤蒸发皿, 转入同一分液漏斗中。 振摇分液漏斗1 . 5 m i n , 静置约1 5 m i n , 使分层后, 将下层甲醇一 水提取液过柱净化, 不要将两相交 界处的白色絮状物放入柱内。 5 . 2 . 2 柱净化 5 . 2 . 2 . 1 小麦及其制品: 在层析柱下端与小管连结处塞约。 . 1 g 脱脂棉, 尽量塞紧, 先装入。 . 5 g 中 性 氧化铝, 敲平表面, 再加
8、入。 . 4 9 活性炭. 敲紧。 将层析柱下端小管插入一橡皮塞, 塞在抽滤瓶上, 抽滤瓶 中放一平底管接受过柱液, 将抽滤瓶接上水泵或真空泵, 稍稍开启泵, 使活性炭压紧, 将分液漏斗中的甲 醇水提取液小心地沿管壁加入柱内, 控制流速为每 1 5 s 1 8 - 2 0 滴C m L / m i n ) , 甲醇一 水提取液过柱快完 毕时, 加入 1 0 m L甲醇一 水( 4, 1 ) 淋洗柱, 抽滤, 直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在 2 -3 m L / m i n , 速度太快净化效果不好, 太慢耗时太长。 5 . 2 . 2 . 2 玉米: 同5 . 2 . 2 . 1 ,
9、只是将活性炭的用量改为0 . 3 g o 5 . 3 制备薄层层析用样液 将过柱后的洗脱液倒人7 5 m L玻璃蒸发皿中, 用少量甲醇一 水( 4, 1 ) 洗涤平底管。 将蒸发皿置沸水 G s / T 1 4 9 2 9 . 5 一9 4 浴 L 浓缩至于。 5 . 3 . 1 小麦: 趁热加入3 m l , 乙酸乙醋, 加热至沸, 在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次, 使充分沸 腾将残渣中的D O N溶出, 并将乙酸乙醋挥发至干, 再加人3 m L乙酸乙酷同样处理一次, 将溶剂挥干, 最后加3 m 1乙酸乙醋, 加热至沸, 放冷至室温后转人浓缩瓶中, 再用三份 1 . 5 m L乙酸乙醋洗
10、涤蒸发 皿, 并入浓缩瓶中。 5 . 3 . 2 小麦制品、 玉米: 趁热加入3 mL乙酸乙醋, 加热至沸, 在水浴锅上轻轻地反复转动燕发皿数次, 使充分沸腾, 将残渣中D O N溶出, 放冷至室温后转入浓缩瓶中。加约。 . 5 m L甲醇一 丙酮( 1 : 2 ) 于蒸发 皿中, 用玻棒搅动溶解残渣, 将蒸发皿置水浴锅上挥千溶剂后, 加入3 m L乙酸乙醋, 加热至沸, 转动蒸 发皿, 使充分沸腾, 放冷至室温后转入同一浓缩瓶中, 再用0 . 5 m L甲醇一 丙酮( 1 : 2 ) 和 3 m L乙酸乙酷 同样处理一次, 乙酸乙酷提取液并人浓缩瓶中。 将浓缩瓶置约9 5 水浴锅上, 用蒸汽
11、加热吹氮气浓缩至干, 放冷至室温后加入。 . 2 m L三氯甲烷- 乙睛( 4 : 1 ) 溶解残渣留作薄层层析用。 5 . 4 M定 5 . 4 . 1 薄层板的制备: 4 g 硅胶G加约9 m L 1 5 % 氯化铝( A I C I , 。 6 H , 0 ) 水溶液, 研磨约2 m i n 至呈粘 稠状, 铺成5 c mX2 0 c m的薄层板三块, 置室温干燥后, 于1 0 5 活化 1 h . 贮干燥器中备用。 5 . 4 . 2 点样: 在每块薄层板上距下端2 . 5 c m的基线上点样。 第一块板: 对每一个样品先点第一块薄层板。在距板左边缘1 . 8 c m处点2 5 p L
12、样液, 在距板上端 1 . 5 c m处的横线上并与基线样品点相对应的位置上点2 p L D O N标准液( 5 0 n g ) , 按5 . 4 . 3 . 1 条下横展 薄层板, 挥干溶剂后再在薄层板上距左边缘1 c m处的基线上点2 p L D O N标准液( 5 0 n g ) , 第二块板: 在第一块板上未显荧光的样品则需在第二块薄层板上距左边缘0 . 8 - 1 c m处滴加2 5 p L 祥液, 加1 川 , 标准液( 2 5 n g ) , 在距左边缘2 c m处滴加1 K L标准液( 2 5 n g ) , 在距右边缘1 . 2 c m处滴加 2 川 标准液。 对阳 性样品可
13、进行概略定量: 在薄层板上距左边缘0 . 8 - 1 c m处滴加样液点( 根据情况估 计滴加点, 或稀释后定量) , 在距板左边缘2 c m处和在距右边缘 1 . 2 c m处分别滴加二个标准点, D O N 的 量可为5 0 n g , 7 5 n g , 1 0 0 n g 。 再在距板上端1 . 5 c m处的 横线上点三个D O N标准点( 各约5 0 n g ) , 使 之与基线上的三个点相对应。 5 . 4 . 3 展开 横展剂: 乙醚、 乙醚一 丙酮( 9 5 : 5 ) 或无水乙醚。 任选其中一种, 使样品D O N点偏离原点。7 -1 c m, 刚好与杂质荧光分开。 纵展剂
14、: 三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇( 8 , 1 , 1 ) 三氯甲 烷一 丙酮一 异丙醇一 水( 7 - 5 : 1 : 1 . 5 , 。 . 1 ) 5 - 4 , 3 - 1 横展: 在展开槽内倒入1 0 m L横展剂。将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂, 展至 板端过 工 2 m i n , 取出通风挥干3 m i n 。 对小麦制品还须再用1 0 m L石油醚( 3 0 -6 0 C ) 横展一次, 展至 板端过 1 m i n , 取出通风挥干5 m i n . 5 . 4 - 3 . 2 纵横: 在展开槽内倒入1 0 m L纵展剂。 将横展挥干后的薄层板置展开槽内纵展1 5
15、c m, 取出通 风挥干1 0 m i n 。 由于D O N与杂质分离的效果受空气湿度影响较大, 当 板面分离效果不太好时即第一块 薄层板的样品点附近有杂质荧光干扰时, 可按极性大小依次换用以下几种展开方式: 三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇( 8 三氯甲烷一 丙酮一 异丙醉( 8 s 1: 1 ) . : 1 : 1 ) 并在展开槽盖内面贴上水饱和的滤纸。 8.阮 三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇一 水( 7 三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇一 水( 7 . 5, 1 1 . 5: 0 . 1 ) a 5 : 1 : 1 . 5: o . l 并在展开槽内面贴上水饱和的滤纸。 改换纵展 已止 方式, 展开第
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