GB-T 4789.34-2003.pdf
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1、GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 前言 本标准的附录A、 附录 B是规范性附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位: 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、 北京市卫生防疫站。 本标准主要起草人: 杨宝兰、 冉陆、 李志刚、 王淑真、 杨大进、 贾珍珍。 GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 双 歧 杆 菌 检 验 范围 本标准规定了双歧杆菌的检验方法。 本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,
2、 随后所有的 修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 食品卫牛微生物学检验染色法、 培养基和试剂 术 语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3 . 1 双歧杆菌B i f i d o b a c t e r i u m 一群能分解葡萄糖, 产生大量乙酸和乳酸, 厌氧, 不耐酸, 不形成芽胞, 不运动, 细胞呈现多样形态的 革兰氏阳性杆菌。 3 . 2 双歧杆菌菌落计数 e n u m e r
3、 a t io n o f B i f i d o b a c t e r i u m 在一定条件培养后, 所得1 m 以g ) 检样中所含双歧杆菌菌落数。 4 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 设备和材料 1 恒温培养箱: 3 6 士1 0 C。 2 恒温水浴锅: 4 6 士1 C。 3 显微镜: l o x一1 0 0 X o 4 厌氧培养装置: 厌氧罐、 厌氧箱。 5 离心机: 3 0 0 0 r / mi n , 6 气相色谱仪: ( 具有氢火焰检测器 F I D ) . 7 架盘药物天平: 。g -5 0 0 g , 精度。 . 5 g
4、, 8 灭菌吸管: 1 ML ( 具 0 . 0 1 刻度) , 1 0 mL ( 具 0 . 1 刻度) 。 9 灭菌平皿 : 直径 9 0 m m. 1 0 广口瓶或锥形瓶: 3 0 0 mL , 5 0 0 mL . 5 培养基和试剂 5 . 1 0 . 8 5 %灭菌生理盐水。 5 . 2 T P Y琼脂培养基 : 见第 A. 3 章。 5 . 3 B I琼脂培养基: 见第 A. 2章。 GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 5 . 4 B B L琼脂培养基: 见第 A . 1 章 5 . 5 双歧杆菌生化用基础培养基: 见第 A . 4 章。 5 . 6 P Y
5、 G液体培养基: 见第 A. 5 章。 5 . 7 革兰氏染色液: 按GB / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中2 . 2 规定。 5 . 8 灭菌液体石蜡 5 , 9 甲醇: 分析纯 5 . 1 0 三氯甲烷: 分析纯。 5 . 1 1 硫酸: 分析纯。 5 . 1 2 冰乙酸: 分析纯。 5 . 1 3 乳酸: 分析纯。 5 . 1 4 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸 5 . 7 mL , 移人 1 0 0 m l 一 容量瓶中. 加水至刻度, 标定, 标定方法 见附录 B , 此溶液浓度约为 1 m o t / L . 5 . 1 5 乙酸标准使用液: 将经标定的乙酸
6、标准溶液用水稀释至 。 . 0 1 -0 1 / 1 - 5 . 1 6 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸 8 . 4 m工 , 移人 1 0 0 m l , 容量瓶中, 加水至刻度, 标定, 标定方法见 附录B, 此溶液浓度约为 1 m o l / L 5 . 1 7 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至 0 . 0 1 mo t/ l _ 6检验程序 检验程序见图 分 纯革兰氏染色, 过氧化氢阵试验 菌 落 计 数 报 告 接 种 w e庆 氧 培 养 A7 C 7 2h 测 定 乙酸 、乳 酸 菌 种 鉴 定 报 告 图1 操作步骤 7 . 1 以无菌操作将充分棍匀的检样 2
7、 5 g ( mL ) 放人含有 2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成 GB/ T4 7 8 9 34 一2 0 0 3 1, 1 。 的均匀稀释液 7 . 2 用 lm L灭菌吸管吸取 1, 10稀释液 lm 工, 沿管壁徐徐注人含有 gm l灭菌生理盐水的试管内, 振摇混匀, 做成 1 10。的稀释液。 7 . 3 另取l m l 一 灭菌吸管, 按上述操作顺序, 作 10倍递增稀释液, 如此每递增一次, 即换用 1 支l m L 灭菌 吸管。 7 . 4 选择 2 个一3个以上适宜稀释度, 分别在作 10 倍递增稀释的同时, 各取 。 . 1,试 分别加人计数培 养基平皿,
8、均匀涂布, 每个稀释度作两个平皿。最好同时选用 2种一3种培养基( B 工 、 B I3I 、 r P Y培养 基), 同时作灭菌生理盐水空白对照。 7 . 5 待琼脂表面干后, 翻转平皿 , 放至厌氧罐内. 操作全过程须在2 Omln内完成 7 . 6 将厌养罐置 36士1 温箱内培养 72 h 士3h , 观察双歧杆菌菌落特征见表 1 。选取菌落数在3 。 30。 之间的平板对可疑菌落进行计数, 随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色、 显微镜检查和过氧化氢 酶试验过氧化氢酶阴性, 革兰氏染色阳性、 无芽胞、 着色不均匀、 出现“ Y, 或“ V” 型的分叉状、 或棒状 等多形态的杆菌可定为双
9、歧杆菌。 表 1 双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征 培 养 基 双歧杆菌特征 BI 培养基为黄色菌落中等大小, 表面光亮, 边缘整齐呈瓷白色、 奶油色, 质地柔软、 细腻 B B I, 培养基为黄色 菌落中等大小, 表面光滑、 凸起, 边缘整齐呈奶油色, 质地柔软、 细腻 TP Y培养基为黄色 菌落表面光滑, 凸起, 边缘整齐呈奶油色、 瓷白色, 质地柔软、 细腻 7 . 7 菌落计数: 根据证实为双歧杆菌的菌落数, 计算出平皿内的双歧杆菌数, 然后乘以样品的稀释倍 数, 得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果例如, 检样 1 只104 倍的稀 释液在 B BI 琼
10、脂平板上, 生成的可疑菌落为 35 个, 取5 个鉴定, 证实为双歧杆菌的是 4个, 则 l ml样 品中双歧杆菌数为: 1 0义3 5义4 / sxl o 咭= 2 . SXI O 6 8双歧杆菌菌种鉴定 8 . 1 生化试验 8 . 1 门菌种制备: 自平板上挑取菌落, 接种于B L 、 B B L或 T P Y琼脂平板 匕, 放至厌氧罐内, 于 3 6 士 1 、 72 h 士3h 厌氧培养。刮取菌苔, 制备菌悬液, 浓度为 109 cfu / mL 一10, , c f u/m L, 分别进行试验。 8 . 1 . 2 生化鉴定试验: 双歧杆菌一般不还原硝酸盐( 但当培养基有溶解的红细
11、胞时, 可以还原硝酸盐) , 不产靛基质和硫化氢。常用双歧杆菌的碳水化合物反应见表2 。 表 2 双歧杆菌属内种的鉴别要点 常用双歧杆菌 D- 核 糖 L阿拉伯糖 乳 糖 一 纤 维 二 搪松 三 糖棉 子糖山 梨 醇淀粉葡 萄 糖 酸 盐 1 分叉双歧杆菌 ( B. b 7 ) 去 d u 功 )一+ 一 一 一 2长双歧杆菌 ( 万 . l o n g u 朋) 十净卜 一一 l一 l 卜 ! + 一一 ! 3 . 婴儿双歧杆菌 t B. z n 和 n t仁 ) 司 L十- 4 . 短双歧杆菌 ( Bb 理v e) + d l 二 5 . 青春双歧杆菌 ( B . a d o l e s
12、 e n t , 5 ) -尸+ 一 + 一 ,J il 一 d一卜 注:d 表示有些菌株阳性, 有些菌株阴性 G B/ T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 8 . 2 气相色谱法分析双歧杆菌的有机酸代谢产物 自平板上挑取菌落, 接种于 P Y G液体培养基, 厌氧 3 6 士1 0C, 7 2 h 士3h 培养, 取除菌上清液分析 双歧杆菌的有机酸代谢产物。双歧杆菌分解葡萄糖, 生成乙酸和乳酸, 形成比约3: 2 。样品经酸化、 离 心后 , 上清液直接进气相色谱仪测定其中的乙酸。样品经硫酸甲醇甲醋化, 以三氯甲烷提取, 取三氯甲 烷层进气相色谱仪测定其中的乳酸。 8 . 2
13、. 1 分析步骤 8 . 2 . 1 . 1 样品处理 8 . 2 . 1 . 1 . 1 乙酸测定: 取除菌上清液 2 m L - - 3 mL , 加人体积分数为 5 0 %硫酸 0 . 1 mL , 混匀 4 0 0 0 r / m i n 离心 5 mi n , 吸取上清液分析。 8 . 2 . 1 . 1 . 2 乳酸测定: 取除菌上清液2 mL -3 mL , 放人 1 0 mL比色管中, 1 0 0 水浴 1 0 mi n , 加人体积 分数为 5 0 写硫酸0 . 2 m L, 甲醇 1 mL , 5 8 水浴 3 0 mi n 后加水 1 mL , 加三氯甲烷 0 . 5 M
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