GBT 19915.9-2005.pdf
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1、I CS 0 7 . 1 0 0 . 3 0 C 5 3 荡黔 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 1 9 9 1 5 . 9 -2 0 0 5 猪链球菌 2 型溶血素基因P C R 检测方法 De t e c t i o n me t h o d o f t h e S t r e p t o c o c c u s s u i s h e m o l y s i n g e n e f o r t y p e 2 b y P C R 2 0 0 5 - 0 9 - 2 7发布2 0 0 5 - 1 1 - 0 1 实施 中 华人民 共和 国国家 质量 监督 检验 检
2、疫总 局 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布 G B/ T 1 9 9 1 5 . 9 -2 0 0 5 前言 猪链球菌 2型是链球菌属的成员, 其致病菌株可致猪链球菌病, 引起猪败血症、 脑膜炎等近年来, 随着我国养猪业的发展, 该病流行日趋严重, 给养猪业带来巨大损失。人可通过伤口感染该菌, 并导致 死亡。溶血素是猪链球菌 2 型一种重要毒力因子。通过检测猪及其产品中分离菌株是否含有猪链球菌 2 型溶血素基因, 可以作为区分猪链球菌 2 型无毒菌株与致病菌株的一个指标, 特制定本标准。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防
3、疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位: 中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、 中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人: 陈国强、 唐泰山、 张敬友、 姜众、 王凯民、 张常印、 林祥梅、 吴绍强、 刘建、 韩雪清、 贾广乐 、 梅琳 。 GB / T 1 9 91 5 . 9 -2 0 0 5 猪链球菌 2型溶血素基因 P C R 检测方法 范 围 本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因 P C R检测的操作方法。 本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌 2 型溶血素基因的检测。 规范性 引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件, 其随后所
4、有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法 术语和定 义 下列术语和定义适用于本标准。 3 . 1 猪链 球菌2 型 S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 2 猪链球菌是属于链球菌属的 一种细菌, 根据其英膜多糖抗原的差异, 可分为1 -3 4 及1 / 2 共3 5 个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型, 不仅对猪致
5、病性很强, 而且可以感染特定的人群, 是 一种重要 的人 畜共患病病原菌 。 缩略语 P CR DN A d NTP b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n , 聚 合酶 链式反应 d e o x y r i b o n u c l e i c a c id , 脱氧核糖核酸 d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e , 脱氧核昔酸三磷酸 b a s e p a i r , 碱基对 测定方法 5 . 1 方法提要 以可疑细菌培养物提取的核酸, 作为D N
6、 A模板进行P C R扩增, 琼脂糖凝胶电泳检测P C R产物, 与 标准分子量标记比较, 来确定扩增产物的大小。 5 . 2 试荆和材料 除另有规定, 所用试剂均为分析纯, 水为符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2的灭菌双蒸水。 5 . 2 . 1 猪链球菌 2型溶血素基因 P C R反应混合物: 1 0 X P C R缓冲液 2 . 5 ti L , 2 5 mm o l / L Mg C l , 2 . 0 p L , 2 . 5 m m o l / L d N T P 2 p L 、 上下游引物各1 p L , 用双蒸水补至2 0 I L 。 引物序列如下, 其目 的
7、片 段长度为 4 9 5 6 p , s l y 1 : 5 0 0 0 , A A G, T T C , A A G , C C G , C A T , T T A 3 ( 1 5 4 2 ) s I y 2 : 5 G A A , G A T , T G C , G A G , C A T , T T C , C T G 3 ( 2 0 3 6 ) 5 . 2 . 2 T a q D N A聚合酶。 GB / T 1 9 9 1 5 . 9 - 2 0 0 5 5 . 2 . 3 琼脂糖: 电泳级。 5 . 2 . 4 澳化乙锭 5 . 2 . 5 酚: T r i s 饱和。 5 . 2
8、 . 6 三氯甲烷。 5 . 2 . 7异戊 醇。 5 . 2 8 异 丙醇。 5 . 2 . 9 7 0 %乙醇。 5 . 2 . 1 0分子量标记 : DL 2 0 0 0 5 . 2 . 1 l 十六烷基三甲基嗅化按( C T AB ) 提取液: 0 . 1 mm o l / L T r i s - HC 1 ( p H 7 . 5 ) , 1 0 m mo l / L E D T A ( p H 7 . 5 ) , 2 % C T A B , 0 . 7 m m o l / L N a C l , I %日 一 琉基乙醇。 5 . 2 . 1 2 TE缓冲液: 1 0 m mo l/
9、L T r i s - H C I ( p H 8 . 0 ) , 1 mm o l / I . E D T A( p H 8 . 0 ) . 5 . 2 . 1 3 1 0 X P C R 缓冲液: 1 0 0 mm o l / L K C I , 1 6 0 m mo l/ L ( NH 4 ) 2 S 0 2 0 mm o l / L Mg S 0 , 2 0 0 mm o l / L Tr i s - HC I ( p H 8 . 8 ) , 1 %T r i t o n X - 1 0 0 , 1 mg / m L B S A. 5 . 2 . 1 4 电泳缓冲液: 2 4 2 g
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