GBT 15398-1994.pdf
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1、中华人民共和 国国家标 准 饲 料 有 效 赖 氨 酸 测 定 方 法 G B / r 1 5 3 9 8 一 9 4 D e t e r mi n a t i o n o f a v a i l a b l e l y s i n e i n f e e d s t u f f s 本标准参照采用国际标准I S O 5 5 1 0 -1 9 8 4 K 饲料有效赖氨酸测定方法 。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了 饲料中有效赖氨酸的测定方法。 本标准适用于含有动物或植物性蛋白质的配合( 混合) 饲料及单一饲料。 2 引用标准 G B 6 4 3 2 饲料粗蛋白测定方法 3 术语 有效赖氨
2、酸是指在规定的测定条件下测得的总赖氨酸和非有效赖氨酸之差。 4 原理 蛋白质中有效赖氨酸的。 一 氨基可与2 . 4 一 二硝基氟苯反应, 酸解后生成二硝基苯赖氨酸, 而其他非 有效部分则生成赖氨酸 因此将不经二硝基氟苯处理的样品和经由二硝基氟苯处理的样品分别水解, 用 离子交换色谱法测定各自的赖氨酸含量, 即可由其差值得出样品中有效赖氨酸的含量。 5 试剂和溶液 本标准所用试剂均为分析纯, 水为去离子水。 5 . 1 乙醚( H G 3 -1 0 0 2 ) 0 5 . 2 碳酸氢钠( G B 6 4 0 ) 溶液: 8 0 g / L , 5 . 3 2 . 4二硝基氟苯( D NF B
3、) 乙醇溶液: 将 一 定量的D N F B溶于9 5 %乙醇, 其体积比为。 . 1 5 : 1 2 , 该溶液用前现配 5 . 4 盐酸( G B 6 2 2 ) 溶液: 6 . 0 m o l / I 。 5 . 5 盐酸( G B 6 2 2 ) 溶液: 6 . 5 m o l / L o 5 . 6 稀释用柠檬酸钠缓冲液: p H约2 . 2 , 将 列试剂依次溶于适量水: 2 0 g 水合柠檬酸( H G 3 -1 1 0 8 ) 8 g 氢氧化钠( G B 6 2 9 ) 1 6 ml浓盐酸( ( ; B 6 2 2 ) 0 . 1 ml辛酸 2 0 m l , 硫二甘 醇 加水
4、稀释至1 0 0 0 n il 国家技术监督局1 9 9 4 门 2 一 3 0 批准1 9 9 5 一 0 7 一 0 1 实施 c s / T 1 5 3 9 8 一 9 4 5 . 了 层析用柠檬酸钠缓冲液: p H值及配制方法依不同型号的氨基酸测定仪有所区别, 请参见仪器说明书配制。 5 . 8 茹二 二 酮试剂 按仪器说明书配制。 5 . 9 赖氨酸标准液: 5 0 n m o l / mL或其他浓度。 先配制2 . 5 p m o l / m l赖氨酸标准贮备液: 称取4 5 . 6 m g 赖氨酸单盐酸盐溶于。 . 1 m o l l _ 的盐酸 中, 稀释至 1 0 0 m l
5、 , 混匀。 用该标准贮备液或商品2 . 5 p m o l / m L的标准氨基酸混合液, 以p H 2 . 2 柠檬酸钠缓冲液为溶剂配 制5 0 . ( ) n m o l / m l 标准液。 也可根据仪器说明书配制成其他最佳使用浓度。 6 仪器、 设备 6 门实验室用样品粉碎机: 能快速一致地粉碎样品并能避免样品过热和尽可能少与外界接触。 6 . 2 样品筛: 孔径0 . 2 5 m m( 6 0目) 。 6 . 3 分析天平: 感量0 . 0 0 0 1 g o 6 . 4 油浴: 温度可稳定于1 2 0 - 1 3 0 之间。 6 . 5 回流水解装置: 1 5 0 m l , ,
6、 5 0 0 m L短颈烧瓶以玻璃磨口 接头与回流冷凝器( 长约3 5 4 0 c m) 相接 6 . 6 离心机: 4 0 0 0 r / m i n 6 . 7 旋转蒸发器。 6 . 8 氦墓酸自动分析仪。 6 . 9 回流水解装置: 5 0 mL水解管或消煮管, 具磨口接头与回流冷凝器相接。 6 . 1 0 金属块消煮炉: 要求温度保持在1 2 0 - 1 3 0 C 之间, 必要时可加继电器和接点温度计控制。 金属块 内消煮管的受热深度应高于或等于2 5 m L消煮液的液面高度。 6 . 1 1 水浴 7 试样制备 采集具代表性的配合( 混合) 饲料或单一饲料, 按四分法缩分制备实验室
7、样品, 取1 0. 2 0 g 粉碎, 使 其全部通过样品筛( 6 . 2 ) 。充分混匀, 装入密闭容器 8 分析步骤 8 . 1 n法 8 门. 1 总赖氨酸 8 门门门酸水解 称取约含5 0 m g 粗蛋白质的样品两份, 置于5 0 0 m L烧瓶( 6 . 5 ) 中, 加入2 5 0 m L盐酸( 5 . 4 ) , 装好回 流冷凝器, 置1 2 0 -1 3 0 C 油浴( 6 . 4 ) 中, 使其徐徐沸腾, 回流水解2 4 h , 取下烧瓶, 冷却。 必要时将酸解液( 连同水解后不溶物) 重新定容至2 5 0 m L 。 过滤, 吸取5 m l - 滤液, 于旋转蒸发器( 6
8、. 7 ) 上, 6 0 C 左右蒸发至干。加水少许, 重复蒸干1 -2 次。 将残渣溶于5 m L稀释用柠檬酸钠缓冲液( 5 - 6 ) , 离心1 0 m i n ( 4 0 0 0 r / m i n ) , 取上清液上机或贮于 具塞小管中冷藏备用。 8 . 1 . 1 . 2 A 9 定 打开氨基酸自动分析仪( 6 . 8 ) , 使柱温, 反应浴温度. 缓冲液及命三酮流速等各种操作参数达到预定 要求, 并按仪器说明 书取 1 定量的赖氨酸标准液( 5 . 9 ) 进行校准。然后在同样条件下取8 . 1 . 1 . 1 中所得 之样品溶液进行测定 8 . 1 . 2 非有效赖氨酸 c
9、B / T 1 5 3 9 8 一 9 4 8 . 1 . 2 . 1 = M基苯化反应 称取约含5 0 m g 粗蛋白 的样品两份, 置于1 5 0 m l 烧瓶( 6 . 5 ) 中, 加入1 m l 碳酸氢钠溶液( 5 . 2 ) , 放 授1 0 m i n , 其间需不时振摇。 再加入6 m l _ D N F B乙醇溶液( 5 . 3 ) , 加盖, 振摇, 注意勿使样品颗粒粘附于 瓶壁 匕 。在室温下暗处放IY L 过夜。 8 . 1 . 2 . 2 纯化 在旋转蒸发器上, 温度不高于4 0 C 条件下 , 将上述反应物蒸干, 加入3 5 m l乙醚( 5 . 1 ) , 振摇或
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