GB-4789.31-1994.pdf
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1、中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌、 志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的 肠杆菌科噬菌体检验方法 G B 4 7 8 9 . 3 1 -9 4 Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f f o o d h y g i e n e E x a mi n a t i o n o f S a l m o n e l l a e , S h i g e l l a e , a n d d i a r r h o e a c a u s a t i v e E s c h e r i c h i a c
2、o l i b y m e a n s o f t h e d i a g n o s t i c t y p i n g p h a g e s e t f o r e n t e r o b a c t e r t a c e a e 1 主题内容与适用范围 本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、 志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的 基本要求、 操作程序和结果判定。 本标准适用于各种食品、 食物中毒的检验, 也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌 检验。 2 引用标准 G B 4 7 8 9 . 4 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 G B 4 7 8 9 . 5 食
3、品 卫生微生物学检验 志贺氏 菌检验 G B 4 7 8 9 . 6 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 G B 4 7 8 9 . 2 8 食品卫生微生物学检验 染色法、 培养基和试剂 3 设备和材料 温箱 : 3 6 士1。 水平仪。 灭菌平皿 : 9 0 mm X 1 5 mm, 定 量 滴 管 : 每 滴 约 。 。 “ 。 用 输 液 用 的 玻 璃 接 管 配 4 合 号 针 头 , 灭 菌 。 橡皮乳头。 灭菌棉签。 酒精灯。 接种棒 , 镍铬丝。 试管架。 月门乙qJ月qJCU工IOU八3 .恤 ,J,JqJ,Jqjq口几J住J,曰 4 培养基和试剂 4 . 1 营养琼脂
4、、 营养肉汤按G B 4 7 8 9 . 2 8 中3 . 7 和3 . 8 进行 中华人民共和国卫生部 1 9 9 4 一 0 3 一 , 8 批准1 9 9 4 一 0 9 一 0 1 实施 G B 4 7 8 9 . 3 1 一洲 4 . 2 蛋白陈水、 靛基质试剂按G B 4 7 8 9 . 2 8 中2 . 1 3 进行。 4 . 3 三糖铁琼脂按G B 4 7 8 9 . 2 8 中3 . 2 4 和3 . 2 5 进行 4 . 4 肠杆菌科诊断用噬菌体, 7 种和3 种。 安瓶启开后用无菌毛细吸管吸出移入灭菌小试管内, 用无菌 胶塞塞紧, 放于 4冰箱备用。 5 检验程序 5 .
5、 1 肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序见图1 : 检样 前增菌、 增菌和分离, 按G B 4 7 8 9 . 4 妇 主 取可疑菌落 咙菌体试脸T S I ( 斜面、 底层、 产气、 Hi s ) 蛋白陈水( 旋基质) 尿素( P H7 . 2 ) , K C N, 赖氨酸 0 - 1 裂解 其他均不裂解 非如左述的 各种裂解结果 各种曦菌体 均不裂解 HZ S t, 靛基质一, 尿素一, K C N-, 赖氨酸+ HE S +, 靛基质+, 尿素一 K ( :N一, 赖氮酸十 日 : 5 一, 艘 基质 一, 尿素一, K C N-, 赖氨酸干/一 非如左述的 各种反应结果 甘嚣醉、
6、山集醉 ONP G + . + 沙门氏菌 血清学试验 非沙门氏菌 沙门氏菌 血清学试脸 沙门氏菌 血清学试验 , 一I + 非沙门氏菌非沙门氏菌 报告 图 1 肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序 3 3 4 G B 4 7 8 9 . 3 1 -9 4 5 . 2 肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序见图2 : 检样 增菌和分离. 按G B 4 7 8 9 . 5 挑取可疑菌落 T S 工 葡萄搪半固休 T S I 底层产酸, 斜面产孩, H y S - 不产气, 无动力 非如左述的 各种反应结果 魄菌体试验 S h 裂解, 并呈现 各种裂解棋式 S h 不裂解 血清学试脸与裂解棋式相符
7、 且被1 R T D S h 裂解 血清学试验与裂解模式不相符 或不被1 R T D S h 裂解 生化分群试验 荀翻精馁试验 必要时加做乙酸钠、 克氏柠徽酸盐, 枯液酸、 七叶普、 水杨普试验 志贺氏菌属 分群及分型结果 葡萄糖铁十 或任何其他阳性结果 非志贺氏菌 非志贺氏菌 非志贺氏菌 报告 图 2 肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序 3 3 5 G B 4 7 8 9 . 3 1 -9 4 5 . 3 肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序见图3 : 检样 增菌和分离, 按G B 4 7 8 9 . 6 乳绪发醉或不发酵 的菌落3 5 个 咙菌体试验 E 和或S h , E
8、- 4 魄菌体不裂解, 其他噬菌体裂解 E 和或S h , E - 4 曦菌体裂解 各种咙菌体均不裂解 氧化醉一, G 一杆菌 不同来像分离的菌株 其裂解棋式 具有同一性 T S I , 旋基质, P H 7 . 2 尿素, K C N , 位氮酸, 动力 T S 底层+ H 2 S -, K C N- 尿素一 非如左述的 各种反应结果 血清学试验 E TE C+ E P E C +或 E HE C ( 0 1 5 7 ) E I EC+ 非如左述的 各种反应结果 肠毒素+ 被氨酸一, 饭基质+, 动力一( 01 2 4 动力+/一) 非大肠 埃希氏菌 产肠毒素大 肠埃希氏菌 肠道致病性或 肠
9、道出血性 大肠埃希氏菌 肠道侵袭性 大肠埃希氏菌 非致坞大 肠埃希氏菌 非大肠 埃希氏菌 报告 图3 肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序 6 检验步驻 6 . 1 前增菌、 增菌和分离 6 . 1 . 1 沙门氏 菌的前增菌、 增菌和分离, 按G B 4 7 8 9 . 4 进行。 3 3 6 G B 4 7 8 9 . 3 1 -9 4 6 . 1 . 2 志贺氏菌的增菌和分离, 按G B 4 7 8 9 . 5 进行。 6 . 1 . 3 致泻大肠埃希氏 菌的增菌和分离, 按G B 4 7 8 9 . 6 进行。 6 . 2 噬菌体试验 6 . 2 . , 培养基的准备 营养琼
10、脂平板( 含琼脂1 %-1 . 5 写, 琼脂量视其凝固 性而定, 约为一般用量的3 / 4 ) , 每个9 c m平皿 中约2 5 m L , 放在水平台面上侯其凝固, 翻转平板, 在 3 6半开皿倒置约 1 h , 以烘干培养基表面水分, 并使琼脂具有显著的吸水性。 6 . 2 . 2 试验菌液的准备 从选择性鉴别平板上挑取菌落, 一般应多挑几个菌落, 以防遗漏。 检验沙门氏菌时, 不但应挑取乳糖 阴性产H 多和不产H 多的菌落, 还应挑取乳糖阳性产H 多的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳 性或阴 性的菌落3 -5 个。 检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体管, 于
11、3 6 培养过夜, 次日 选取三糖铁底层产酸、 斜面产碱, 不产H z S , 不产气无动力的培养物。 下述两种方法可供选用。 6 . 2 . 2 . , 一法: 将待试菌落接种于营养肉汤管内, 于3 6培养过夜。挑取此肉汤培养物一满环, 稀释 于一管盛有1 -2 m L 的蛋白膝水试管内, 使成为1 - 2 0 0 1 “ 4 0 0 稀释菌液, 含菌量约为1 X 1 0 6 / m l , . 6 . 2 . 2 . 2 二法: 用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌落, 挑取菌量不宜过多, 稀释于一管盛有 1 -2 m L蛋白陈水试管内, 使其含菌量约与一法相似。 6 . 2 . 3涂抹试验
12、菌液 6 . 2 . 3 . 1 斑点徐抹法: 将营养琼脂平板表面自圆心起分为三等份, 每等份可供涂抹一株细菌培养物。 每挑取试验菌液一满环, 涂抹直径约1 c m的菌斑一个。 每株培养物涂抹7 个菌斑, 外圈4 个, 内圈3 个。 6 . 2 - 3 . 2 棉签涂抹法: 用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体, 在如上琼脂平板表面三分之一的 区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离。 略等数分钟, 俊菌液干燥。 6 . 2 . 4滴加噬菌体 用定量乳头滴管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴, 依次为O - 1 、 C , S h , E , C E , E - 4 和E n t 。 滴管上安 装4
13、号针头, 每毫升约为1 0 0 滴。 每支滴管只 滴加一种噬菌体, 针尖绝对不能接触平板表面, 严格防止交 叉污染。 每用一支滴管, 可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。 滴加噬菌体时必须将 琼脂平板放在水平台面上。 待7 种噬菌体均滴加完毕后, 略等数分钟, 待噬菌体液干燥。翻转平板, 放 3 6 培养5 -6 h , 并过夜各观察一次结果。 如果仅有一两株培养物作噬菌体试验, 则可用直径为3 m m的接种环挑取噬菌体, 依次滴加在菌斑 上。 灼热的接种环必须完全冷却以后方可挑取噬菌体。 6 . 2 . 5 试验结果的判定 按表1 判定噬菌体试验的结果。 必要时吸取少许剩余的蛋
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