SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 毕业论文.doc
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1、编号: 2011 届本科毕业论文(设计) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方 法的改进 学 院 生 命 科 学 学 院 专 业 生 物 科 学 学 号 200740810235 姓 名 指导教师 职称 副教授 完成日期 2011 年 5 月 ii 诚 信 承 诺 我谨在此承诺:本人所写的毕业论文SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 染色方法的改进均系本人独立完成,没有抄袭行为,凡涉及其他 作者的观点和材料,均作了注释,若有不实,后果由本人承担。 承诺人(签名): 年 月 日 iii 目录目录 摘摘 要要1 1 关键词关键词1 1 A ABSTRACT1 1 KEYWORDSKEYWORDS1 1 引言引言
2、1 1 1.1. 材料与方法材料与方法2 2 1.11.1 实验材料实验材料2 2 1.1.11.1.1 试剂试剂2 2 1.1.21.1.2 主要仪器、设备主要仪器、设备2 2 1.21.2 实验方法实验方法2 2 1.2.11.2.1 溶液的配制溶液的配制2 2 1.2.21.2.2 制胶制胶3 3 1.2.31.2.3 电泳电泳4 4 1.2.41.2.4 染色染色5 5 1.2.4.11.2.4.1 传统考马斯亮蓝染色法传统考马斯亮蓝染色法5 5 1.2.4.21.2.4.2 水浴加热法水浴加热法5 5 1.2.4.31.2.4.3 微波炉加热法微波炉加热法5 5 1.2.51.2.5
3、 染色结果观察染色结果观察6 6 2.2. 结果与分析结果与分析6 6 2.12.1 染色效果与操作的染色效果与操作的简便性简便性6 6 2.22.2 不同染色方法凝胶成像结果不同染色方法凝胶成像结果7 7 2.32.3 染色时间染色时间7 7 3 3结论与讨论结论与讨论8 8 参考文献参考文献8 8 iv 致致 谢谢1010 1 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 摘摘 要要:针对传统的SDS- PAGE染色法耗时长,脱色所用甲醇有毒,乙醇会同时把考马斯亮蓝颜色脱去, 使蛋白质条带不清晰等问题,对常染法进行了改进。本文用水浴或微波加热处理,同时改
4、变染色液和脱色 液成分,用乙醇、蒸馏水代替甲醇,大大缩短了染脱时间,经过比较,认为改进后的水浴法所耗时间大大 缩短,染色效果也较好。 关键词关键词:SDS- PAGE;考马斯亮蓝;水浴法;染色;脱色 A Modified Method for SDS-PAGE Staining Abstract: For the traditional SDS-PAGE time-consuming staining, Coomassie brilliant blue color can be taken off by the ethanol used for bleaching, methanol is t
5、oxic,the protein bands is not clear, and other issues,an improved method for the common dyeing is coming.By using a water bath or microwave heat treatment, at the same time changing the composition of dyeing and bleaching liquid,ethanol,distilled water instead of methanol,reducing the time of dyeing
6、 off greatly.By comparision,that the bathing method improved reduces the time significantly, dyeing better. Keywords:SDS- PAGE;coomassie brilliant blue;water bathing ;staining; decolorization 引言 继人类基因组计划之后,蛋白质组学已经成为21世纪生命科学研究的热点, 对蛋白质高分辨率的分离和准确鉴定变得至关重要。目前分离蛋白质的主要方 法之一就是采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS- Poly
7、acrylamide Gel Electrophoresis, SDS- PAGE),它的支持介质是三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。 在催化剂的作用下,单体丙烯酰胺(acrylamide,Acr)与N,N-甲叉双丙烯酰 胺(N,N-methylene bisacrylsmide,交联剂 ,Bis)发生聚合反应,生成凝胶介 质。由于不同蛋白质分子大小和所带电荷的不同,从而对蛋白质进行分离,而 分离后的电泳凝胶检测的染色方法也有多种,其中考马斯亮蓝染色法由于具有 很强的特异性、较少的干扰因素、操作简便等优点,而成为蛋白质电泳检测和 定量分析的一种常用方法。常用的考马斯亮蓝有G-250,R350,和R-2
8、50三种, 在游离状态下,考马斯亮蓝G-250为红色,其最大吸收值为488 nm;而它与蛋白 质结合后颜色由红色变为青色,在595 nm 波长下二者的结合物光吸收最大,光 吸收值和蛋白质的含量成正比关系,所以可用于蛋白质的定量测定1。考马斯 亮蓝G-250是快染,能与蛋白质迅速进行结合反应,约2 min 即可达到平衡;它 2 们的结合物在室温下1 h 内保持稳定。一般情况下传统考马斯亮蓝染色法染脱 时间较长,约 6 24 h2 ,同时在多次漂洗、换液的过程中,凝胶表面容易被 污染3,而且凝胶中的SDS会干扰考马斯亮蓝和蛋白质的结合,使染色效果受 到影响。同时常染所用的甲醇易挥发,在人体代谢作用
9、下会转化为甲酸,进而 在人眼睛部位积累,对视神经细胞进行破坏,危害操作者健康4。 本文采用考马斯亮蓝G-250进行染色,通过水浴和微波热处理法,对传统的 考马斯亮蓝染色法进行改进,以期达到大大缩短凝胶染色、脱色时间,从而使 操作更简便,所用试剂更少,成本更低,更有利于操作者的健康的目的。 1. 材料与方法 1.11.1 实验材料 1.1.11.1.1 试剂 浓硫酸,甘油,巯基乙醇,N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED) ,浓缩胶缓 冲液(1 M的Tris-HCl pH 6.8) ,无水乙醇,冰乙酸,双蒸水,牛血清白蛋白 (68 kb) ,考马斯亮蓝G-250,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺
10、,溴酚蓝,十二 烷基磺酸钠(SDS),甘氨酸,Tris碱,过硫酸胺。 1.1.21.1.2 主要仪器、设备 直流稳压电源,水平脱色摇床(太仓科技器材厂) ,移液枪,垂直电泳槽, 凝胶成像分析仪(金西盟北京仪器有限公司) ,pH计,量筒,烧杯,容量瓶, 电子天平(奥豪斯仪器上海公司) ,低温冰箱(合肥美菱有限公司),双蒸水蒸馏 器,灌胶支架,电磁炉(九阳股份有限公司) ,水浴锅,微波炉等。 1.21.2 实验方法 1.2.11.2.1 溶液的配制5 1.2.1.11.2.1.1 30 %的丙烯酰胺 用电子天平分别称取丙烯酰胺29.2 g,N,N亚甲基双丙烯酰胺0.8 g,用 60L热的双蒸水溶解
11、,过滤,定容到100 L。 (由于未聚合的丙烯酰胺和甲 叉双丙烯酰胺具有神经毒性,操作均须戴口罩手套,并在通风处进行,保存于 棕色瓶中,4 存放。 ) 1.2.1.21.2.1.2 10%十二烷基硫酸钠(SDS) 用电子天平称取10 gSDS粉末,于90 mL双蒸水中加热至68 溶解,定容 至100 mL,室温保存。 3 1.2.1.31.2.1.3 10 %过硫酸胺(AP) 称取0.5 g过硫酸铵于5 mL双蒸水中溶解,4保存(需新鲜配制) 。 1.2.1.41.2.1.4 分离胶缓冲液(1.5 M的Tris-HCl pH 8.8) 用电子天平称取18.16 gTris粉末,于80 mL双蒸
12、水中溶解,pH计测量并用浓 盐酸调节pH至8.8,后定容至100 mL,4 保存。 1.2.1.51.2.1.5 Tris-甘氨酸5 X电泳缓冲液 分别用电子天平称取6.0 gTris粉末和28.8 g甘氨酸,用900 mL双蒸水溶解, 再加入1 gSDS,用容量瓶定容至1000 mL。 1.2.1.61.2.1.6 5 X上样缓冲液 分别量取0.6 mL 1M Tris-HCl pH6.8缓冲液,5 mL 50%的甘油,2 mL 10 % 的SDS,0.5 mL巯基乙醇,1 mL 1 %溴酚蓝,0.9 mL双蒸水,混合,4保存待 用。 1.2.1.71.2.1.7 蛋白质原液的配制 称取0.
13、1 g的牛血清白蛋白,于100 mL双蒸水中溶解,即为1000 g/mL的蛋 白质原液。 1.2.21.2.2 制胶6 1.2.2.11.2.2.1 确定所要配制分离胶的浓度和体积。 表 1 SDS-PAGE 凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓 度(%)1512.5107.55.0 蛋白质线性 分离范围( kDa) 15-43515-60 18-75 30-120 60-212 由于实验所用标准蛋白的分子量为68 kb,并结合其他文献综合考虑应选择 浓度为10 %的分离胶。先用洗涤剂分别把玻璃板,样品梳,Space洗净,双蒸水 冲洗几次,吹风机吹干。 把Space安装到制胶架上,按要求用制胶模安装
14、并固 定好玻璃板(两边均匀用力),插入梳子后,在距齿底约1 cm的地方用记号笔做 个标记,去除加样梳,以有利于目测分离胶灌制的大致位置。 1.2.2.21.2.2.2 配制8 ml 10 %的分离胶。 4 表2 分离胶的配制比 TEMED为加速剂应最后加入,烧杯中迅速混合均匀后,向玻璃板间一次性 缓缓灌制分离胶到标记处,并立即沿玻璃壁来回移动注入一层双蒸水,水封, 以排空气7。约20 min后在分离胶和水层间出现一清晰界面,即表明胶已聚合5。 1.2.2.31.2.2.3 待分离胶聚合完全后,倒去上层双蒸水,并用滤纸吸干。再配制3.0 mL 6%的浓缩胶。 表3 浓缩胶的配制比 双蒸水1 MT
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