miR-430基因簇的生物信息学分析毕业设计论文.docx
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1、南京邮电大学本科生毕业设计(论文)南京邮电大学 毕 业 设 计(论 文)题 目miR-430基因簇的生物信息学分析专 业生物医学工程学生姓名王凯班级学号B09090321指导教师李小慧评阅教师指导单位地理与生物信息学院 日期: 2013 年 3 月 1 日至 2013 年 6 月 1 日毕业设计(论文)原创性声明本人郑重声明:所提交的毕业设计(论文),是本人在导师指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容外,本毕业设计(论文)不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本研究做出过重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明并表示了谢意。 论文作者签名: 日期:
2、年 月 日摘 要microRNAs (miRNAs) 是由基因组非蛋白质编码序列编码的一类小RNA(19-24 nt),miRNA与靶基因的转录产物互补结合,导致mRNA降解、翻译抑制, 调节靶基因的表达。miRNA对动植物的生长、发育等各种生命活动发挥着至关重要的调节作用。通常多个miRNA基因在染色体上聚集排列形成miRNA基因簇,这些 miRNA 基因簇在不同物种中有较高的保守性,miRNA 基因簇在功能上比单个miRNA的作用更高效,对 miRNA基因簇进行研究,有利于深入了解 miRNA 所参与的复杂调控网络。miR-430基因簇最早在斑马鱼中被发现,是目前已知的最大的miRNA基因
3、簇之一。miR-430簇分布在斑马鱼4号染色体上约20kb的一个区域内,三个miRNA(mir-430a,c和b)组成了三联体,并以此为基本单元进行复制。miR-430在早起胚胎发育中丰度最高,通过抑制和降解母源基因在母源调控向合资调控的转换过程中起到重要作用。本课题主要开展miR-430基因簇分子进化分析研究。主要的步骤:从miRBase数据库中获得数据,即已知的mir-430基因的成熟序列。根据斑马鱼、青鳉、红鳍东方鲀等物种的mir-430基因的成熟序列通过同源性对比的方法在所有动物物种中进行搜索,利用 BLAST软件进行相似性比较的分析。利用CLUSTALW软件进行渐进的多序列比对。利用
4、MEGA 4.1软件,以mir-430基因簇中的mir-430成员成熟序列构建系统进化树。本课题的目的主要是根据miRNA基因在物种间的保守性,利用生物信息学同源性搜寻、对比的方法,探讨miR-430 基因簇的分子进化规律,揭示 miR-430基因簇的起源及相关物种的进化关系,为其调控网络的研究提供理论基础。关键词:MIR-430、NCBI、Blast、ClustalW、MEGA 4.1ABSTRACTmicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-protein coding sequence encoded by the genome RNA (19
5、-24 nt) miRNA target gene transcripts complementary binding, leading to mRNA degradation, translational repression, regulate expression of target genes. miRNA growth, development and other activities of life on plants and animals play a crucial regulatory role. Usually multiple miRNA genes are arran
6、ged to form miRNA gene cluster on chromosome gathered, these miRNA gene clusters were conserved in different species, miRNA gene clusters are functionally more efficient than a single miRNA miRNA gene cluster study , is conducive to the understanding of miRNA involved in complex regulatory networks.
7、 miR-430 gene cluster was first found in zebrafish, is the largest known miRNA gene cluster one. miR-430 cluster located within an area of about 20kb zebrafish chromosome 4, three miRNAs (miR-430a, c and b) the triplet, and use it as the basic unit of replication. miR-430 in early embryonic developm
8、ent in the abundance of the highest in the maternal regulation play an important role in the conversion process of joint control by inhibiting the degradation of the maternal gene. Topics using molecular evolution analysis. Main steps: data obtained from the miRBase database, each species precursor
9、of miR-430 gene sequence. Precursor sequence of miR-430 gene in zebrafish, medaka, red fins puffer species by homology comparison method in all animal species to search using BLAST software for the analysis of the similarity comparison. Use of CLUSTALW Software progressive multiple sequence alignmen
10、t. Use MEGA 4.1 software, the precursor sequence of miR-430 members of the miR-430 gene cluster phylogenetic tree was constructed.The purpose of this project is based on miRNA genes conserved between species, bioinformatics homology search, contrast, investigate the molecular evolution of miR-430 ge
11、ne clusters law, to reveal the origin of the miR-430 gene cluster and relatedthe evolutionary relationships of the species, for the study of regulatory networks provide a theoretical basis.KEY WORD :MIR-430; NCBI;Blast;ClustalW;MEGA 4.1目 录第一章 引言11.1 miRNA生物发生及作用机制21.1.1 miRNA的生物发生21.1.2 miRNA作用机制21.
12、2 miRNA基因的结构特征31.3 miRNA命名规则31.4 miRNA相关功能41.4.1 miRNA对动物发育的调控作用41.4.2 miRNA对动物疾病发生的影响51.4.3 miRNA对动物细胞增殖和凋亡的影响51.5 miRNA鉴定方法61.6 miRNA对基因表达的影响71.6.1 miRNA对靶基因表达的整体调节作用71.6.2 miRNA与靶基因表达的关联效应71.6.3 miRNA在小鼠不同发育阶段对靶基因表达谱影响81.6.4 miRNA对靶基因表达调控的倾向性81.7 miRNA基因进化模式81.7.1 miRNA基因簇进化91.7.2 miRNA基因家族进化9第二章
13、 miRNA-430基因家族进化及功能分析102.1 miRNA-430的分布与串联复制102.2 miRNA-430的功能和特点10第三章 miRNA-430基因簇分析使用软件介绍123.1 miRBase数据库123.2 NCBI133.3 BLAST软件143.4 CLUSTALW软件153.5 MEGA 4.1软件15第四章 miRNA-430基因分子进化研究174.1 数据与方法184.1.1 数据184.1.2 序列对比分析方法184.2 已知的mir-430基因簇的分析184.2.1 已知的mir-430基因簇序列处理184.2.2 利用CLUSTALW软件对mir-430基因簇
14、进行多序列比对194.2.3 利用MEGA 4.1软件构建系统进化树204.3 其他mir-430基因簇的搜索与分析234.3.1 通过NCBI 搜索mir-430基因簇的序列234.3.2 物种序列命名244.3.3 将命名后的基因簇做成FASTA文件254.3.4 利用CLUSTALW对物种的mir-430基因簇进行多序列比对264.3.5 利用MEGA 4.1软件构建mir-430基因簇的系统进化树284.4 讨论31第五章 全文总结32结束语33参考文献34致谢35附录36南京邮电大学2013届本科生毕业设计(论文)第一章 引言1958年,DNA双螺旋结构的发现者之一,佛朗西斯.克里克
15、1提出了分子生物学的中心法则,即“遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,完成遗传信息的转录和翻译的过程,也可以从DNA传递给DNA,完成DNA的复制过程”。这是所有具有细胞结构的生命所遵循的普遍法则。根据这一原理,RNA分子在生命过程中主要起信息传递,指导细胞蛋白质合成的作用。然而,,随着近年来非编码RNA分子,特别是microRNA(miRNA)的发现,这一原则正遇到越来越多的挑战。miRNA是一类长度约为22个核普酸的内源性非编码RNA分子,可通过干扰mRNA指导蛋白合成过程,负向调节蛋白编码基因的表达。作为一类进化上保守的、起重要调控作用的分子,miRNA通过与靶标mRN
16、A分子3一非编码区(3.-untranslated region,3-UTR)完全或非完全互补结合,miRNA能有效抑制相关蛋白的合成,或导致靶mRNA降解,产生基因沉默效应。研究表明,miRNA可能为调节基因表达的转录后调控的中心分子。目前已在多个门类的生物中发现miRNA的存在,包括植物、动物、某些病毒和藻类等。研究表明miRNA可能存在于所有多细胞生物以及少数单细胞生物中,起基因表达调控的作用。早在1993年,Lim等人2采用定位克隆的方法在线虫(Caonorhabdttis legans)中发现了第一个miRNA分子lin-4。Lin-4基因不编码蛋白,,而是产生一种小分子RNA,,这
17、种小分子RNA能与靶mRNA的3-UTR相互作用,从而抑制Lin-14基因表达。Lin-4的缺失导致线虫幼虫由L1期向L2期的转化发生障碍。这一发现当时并未引起人们重视,直到2000年第二个miRNA一let-7的发现,miRNA在基因表达调控领域的重要作用才逐渐被人们所认识。与lin-4类似,let-7与lin-41基因的3-UTR互补结合抑制其蛋白表达。Let-7序列与行为模式在包括人类在内的多个物种中高度保守,暗示了miRNA的调控行为可能是一种普遍的模式。目前己有数以千计的miRNA在不同物种中被发现。迄今为止,在miRBase数据库中己有15,172条己注释的miRNA序列。其中包括
18、:1048条人类miRNA,672条小鼠miRNA,176条果蝇miRNA,175条线虫miRNA以及213条拟南芥miRNA。预计在人类基因组中编码的miRNA分子的基因总数可能占到基因总数的2-3%,它们可能多种物学过程中扮演了重要的角色。己证实miRNA参与到包括胚胎发育、细胞凋亡、细胞分裂、分化、死亡、造血作用、癌症发生以及病毒感染等多种基因表达调控途径。对这些小分子RNA相关的生物信息学与进化分析的基因序列、加工表达方式、功能等方面的研究表明其系统发育广泛性与进化保守性的特点,暗示了其在生命活动中复杂的调节方式,并可能对构建多细胞组织起精确调控遗传网络的作用。1.1 miRNA生物发
19、生及作用机制1.1.1 miRNA的生物发生miRNA的生物发生是一个多步骤过程。以动物为例,多数miRNA过RNA聚合酶,少数通过RNA聚合酶转录为长度在数百至数千核普酸的初级转录本,初级转录本其5-端多具有7-甲基鸟嘿吟帽子,3-端具有poly(A)结构。在细胞核中,初级转录本在辅助因子DGCR8帮助下被核酸酶Drosha加工成长度约为60-80nt的非完全互补茎-环结构,称为前体miRNA。前体miRNA在辅助因子Ran的参与下,与细胞膜转运蛋白Exportin-5结合,,由细胞核转移至细胞质中,这一过程需要以及GTP的水解提供能量。在细胞质中,前体miRNA在另一种核酸酶Dicer:及
20、其辅助因子TRBP作用下,,被进一步切割为18-24nt的双链miRNA分子。其中的一条或两条链同时作为成熟的miRNA分子与蛋白质结合形成核糖核蛋复合体miRNP,或称为RNA诱导沉默复合物,其后miRNA通过与靶基因mRNA3-UTR区互补配对,发挥基因表达调控作用。植物细胞中miRNA的发生过程与动物miRNA稍有不同,其加工过程主要在细胞核内完成。Pri-miRNA在细胞核内由Dieer-like protein和其他蛋白,如HYLI的参与下加工为pre-miRNA,pre一m1RNA进一步被DCLI加工为miRNA-miRNA*双链复合体,之后被HENI蛋白甲基化后在HASTY蛋白(
21、与动物ExPortin-5基因同源)的协助下从细胞核运往细胞质,在解旋酶作用下加工为成熟的miRNA,降解特定的靶基因。1.1.2 miRNA作用机制miRNA与靶标mRNA通过碱基互补配对而发生作用,通常miRNA5-端的第2-8个核普酸对于miRNA发挥调节功能至关重要,这段区域与3-UTR靶位点完全互补配对,被称为seed区,其在同源miRNA中通常保守。miRNA靶序列在不同物种中也通常保守。已证实miRNA主要存在两种不同的作用机制:降解mRNA或抑制mRNA翻译。通常情况下,如果miRNA与mRNA的3-UTR非完全互补结合,则mRNA不被降解而产生翻译抑制,如果二者具有较高互补程
22、度或完全互补,则导致mRNA降解。通常认为在动物细胞中miRNA与靶基因序列具有较弱的互补性,多导致翻译抑制。通过高通量表达谱分析表明,,动物miRNA对多个mRNA同时产生降解作用,造成靶基因mRNA表达水平的不同程度的下降也可能是一种普遍的现象。相对而言,在植物细胞中miRNA通常与靶基因有较高程度的配对,因而多导致靶mRNA的降解,而较少看到翻译抑制的现象存在,,如miR-39或miR-171与其靶mRNA完全互补,切割降解靶基因mRNA。1.2 miRNA基因的结构特征miRNA基因通常位于蛋白编码的基因间区域,约有三分之一的miRNA位于已知蛋白编码基因内含子区的有义或反义链上,mi
23、RNA前体在同一或不同染色体中常呈单拷贝或多拷贝存在,2-3个甚至更多个miRNA基因排列在一起,共同转录为多顺反子RNA。例如miR-17-92基因簇,在人类中共由6个成员组成,而在果蝇中则由8个成员组成。Ambros等人3提出了miRNA基因识别与鉴定的一系列标准:(l))通过Northem等方法可以从RNA样品中检测到22nt左右的转录本;(2))由分级分离得到的RNA分子构建的cDNA文库中得到的长度为22nt左右的序列,这些序列必须精确地与来源生物的基因组序列相匹配;(3))具有可以预测的发夹结构前体,在其中一条臂上具有成熟的miRNA分子。该发夹结构必须具有最低的能量状态,并且在发
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