[精品论文]基质金属蛋白酶-7 诱导细胞解离参与调控.doc
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1、精品论文基质金属蛋白酶-7 诱导细胞解离参与调控胰腺癌细胞侵袭转移的分子机制刘信1,赵国华2,谭晓冬1,王怀涛1,朱海军1,张峻1,李捍司1,杨一帆1,5王兆平1,孙杨1(1. 中国医科大学附属盛京医院胰腺甲状腺外科,沈阳 110004;2. 辽宁省肿瘤医院胃科,沈阳 110042) 摘要:目的:探讨基质金属蛋白酶-7(Matrix metalloproteinase-7,MMP-7)通过诱导细胞解 离参与调控胰腺癌细胞侵袭转移的分子机制。方法:我们利用解离型胰腺癌细胞系 PC-1.010和 AsPC-1 以及非解离型胰腺癌细胞系 PC-1 和 Capan-2,通过 Western 杂交、体外
2、侵袭实验 和免疫组化进一步明确 MMP-7 参与调控胰腺癌细胞侵袭转移的分子机制。结果:1)细胞 内 MMP-7 蛋白以前酶原的形式存在,AG1478(EGFR 抑制剂) 或 U0126(MEK 抑制剂)能够 抑制 MMP-7 在胰腺癌细胞中的表达。仅在胰腺癌细胞 PC-1.0 和 AsPC-1 的培养液上清中检测出活化型 MMP-7 蛋白,在胰腺癌 PC-1 和 Capan-2 的培养液上清中却未检测出相应蛋白15表达。2)MMP-7 不仅可以诱导岛样细胞克隆方式生长的 PC-1 和 Capan-2 细胞的解离,还 可以破坏细胞间紧密连接并诱导紧密连接蛋白向细胞质或细胞培养液上清中转移。3)
3、 MMP-7 明显诱导 PC-1 和 Capan-2 细胞体外侵袭能力增强。4)胰腺癌组织边缘的侵袭部位 MMP-7 蛋白表达明显强于胰腺癌组织的中心部位。关键词:MMP-7;侵袭转移;胰腺癌;信号转导通路;紧密连接20中图分类号:R735.9Involvement of matrix metalloproteinase-7 in invasion-metastasis through induction of cell dissociation in pancreatic cancer25LIU Xin1, ZHAO Guohua2, TAN Xiaodong1, WANG Huaitao1
4、, ZHU Haijun1, ZHANG Jun1, LI Hansi1, YANG Yifan1, WANG Zhaoping1, SUN Yang1(1. China Medical University Shengjing Hospital, Department of Pancreatic and ThyroidalSurgery, ShenYang 110004;2. The tumor hospital of Liaoning Province,the stomach department, ShenYang 110042)30Abstract: Objective: To inv
5、estigate the underlying mechanism of involvement of MMP-7 ininvasion-metastasis of pancreatic cancer. Method:To clarify the underlying mechanism of involvementofMMP-7incancerinvasion,westernblotting,invasionassayand immunohistochemistry were performed in dissociated (PC-1.0 and AsPC-1) and non-disso
6、ciated(PC-1 and Capan-2) pancreatic cancer cells. Result: 1)Intracellular MMP-7 protein presented as35pre-proenzyme and its expression was decreased by AG1478 (EGFR inhibitor) or U0126 (MEKinhibitor) treatment in pancreatic cancer cells. Activated MMP-7 protein was only detected in medium of PC-1.0
7、and AsPC-1 cells, but not detected in medium of PC-1 and Capan-2 cells. 2)MMP-7 treatment significant induced the dissociation of cell colonies in PC-1 and Capan-2 cells. Synchronously, TJ structure was apparently disrupted and translocation of TJ proteins to40cytoplasm or extracellular medium was i
8、nduced in PC-1 and Capan-2 cells. 3)MMP-7 treatmentmarkedly increased the in vitro invasion of PC-1 and Capan-2 cells. In addition, MMP-7 expression at the invasion front was obviously stronger than that at the center of pancreatic cancertissues. 4)Activation of MMP-7 protein is closely involved in
9、disruption as well as invasion inpancreatic cancer. EGFR mediated MEK/ERK signaling pathway is implied to be involved in基金项目:高等学校博士点专项科研基金(20092104120014)作者简介:刘信,(1987-),男,安徽淮南人,硕士,从事胰腺癌的基础和临床研究。通信联系人:谭晓冬,(1971-),男,满族,辽宁沈阳人,教授,博士生导师,主任医师,从事胰腺癌的 基础和临床研究。 E-mail: - 10 -45regulation of MMP-7 expression
10、 in pancreatic cancer cells.Keywords: MMP-7; invasion-metastasis; pancreatic cancer; signal transduction pathway; tightjunction0引言50胰腺癌诊断时通常已出现局部或远隔转移,以至于无法进行根治性手术治疗。目前胰腺 癌细胞侵袭转移的分子机制尚未完全明确。目前已知癌细胞从原发部位的解离是侵袭转移过 程中重要的第一步1,明确癌细胞解离的分子机制有助于阐明胰腺癌侵袭转移的分子机制, 从而为开发针对胰腺癌侵袭转移的新型诊断和治疗方法提供新的靶标。前期研究中建立了两种具有不同侵袭
11、转移能力的仓鼠胰腺癌细胞系:非解离型低转移株55细胞 PC-1 和解离型高转移株细胞 PC-1.0 2,3。上述细胞系表现为完全不同的生长方式,非 解离型低转移株细胞 PC-1 呈岛样细胞克隆方式生长,解离型高转移株细胞 PC-1.0 呈单个细 胞方式生长。此外,EGFR(Epidermal growth factor receptor)介导的 MEK2(mitofen-acticated protein kinase kinase 2)/ERK2(extracellular signal-regulated kinase 2)信号转导通路通过破坏 解离胰腺癌细胞间的紧密连接,从而参与调控胰腺
12、癌细胞的解离及侵袭转移4-10。60另外,基质金属蛋白酶-7 可以分解很多底物,例如:纤维蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚 糖、弹性蛋白、明胶、型胶原、聚集蛋白聚糖、巢蛋白11,12。MMP-7 在其他蛋白激酶(纤 溶酶原、MMP- 1、MMP-2、MMP- 9 等)活化过程中也起着重要的作用13。同时,MMP-7 较其它 MMP 分子在胰腺癌侵袭的程度、淋巴结和远处转移、以及进展期肿瘤的发展中起着 更加重要的作用14。但是目前 MMP-7 调控侵袭转移过程的具体机制尚未完全明确。65本研究通过检测 MMP-7 和紧密连接蛋白的表达,进一步阐明 MMP-7 参与调控胰腺癌 细胞解离及侵袭转移的分子机制
13、。1材料和方法1.1 细胞系和细胞培养本实验采用仓鼠胰腺癌细胞系 PC-1.0 和 PC-1,其中非解离型胰腺癌细胞系 PC-1 是通70过 BOP 注射于叙利亚仓鼠的胰腺内而诱导产生的胰腺导管/小导管腺癌而建立2。解离型胰 腺癌细胞系 PC-1.0 是由同系仓鼠皮下接种 PC-1 细胞后产生的肝转移瘤而建立的3。本研究 还采用了人解离型(AsPC-1)和非解离型(Capan-2)胰腺癌细胞系。与 PC-1 细胞相类似, Capan-2 细胞也呈岛样细胞克隆方式生长,而与 PC-1.0 细胞相类似与 Aspc-1 细胞呈单个细 胞方式生长4。75所有细胞均在 RPMI-1640 培养液中(Gi
14、bco-BRL 公司,美国)培养,培养基中加入 10%的胎牛血清(Bioserum 公司,澳大利亚)、100U/ml 的青霉素 G 和 100ug/ml 的链霉素,于37含 5%CO2 和 95%空气的培养箱中培养。上述细胞在进行免疫细胞化学实验前进行无血 清培养。1.1.1组织标本80所有的组织标本均为 2009 年 10 月至 2011 年 7 月在中国医科大学附属盛京医院外科手 术时获得。标本来自于 37 例胰腺癌患者,患者平均年龄为 63.5 岁(35-78 岁),包括 14 位 男性和 23 位女性。组织病理学诊断包括:高分化腺癌 13 例,中分化腺癌 20 例和低分化的 腺癌 4
15、例。所有的组织标本均经组织学检查和病理诊断证实。8590951001051.1.2抗体采用兔抗人的 MMP-7、claudin-1、occludin 和 ZO-1(Zonula occludens-1,紧密连接蛋 白)多克隆抗体作为一抗(Oncogene Research Products 公司,美国),以若丹明标记的荧光 抗体作为二抗(Santa Cruz Biotechnology 公司,美国)。1.1.3细胞裂解产物的制备上述四种胰腺癌细胞系在含有 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液的培养皿中培养。实 验前 24 小时替换成无血清的培养液,实验组细胞加入 10uM 特异性 EG
16、FR 抑制物 AG1478(Calbiochem 公司,美国)15、10uM 特异性的 MEK 抑制物 U0126(Cell Signaling Technology公司,美国)16或 100ng/ml 人纯化 MMP-7(一种酶原与酶的混合物,Sigma 公司,美国)。 收集培养液上清并用 Vivaspin 浓缩器(Vivascience 公司,德国)浓缩 50 倍。之后加入1ml RIPA 缓冲液(50 mM Tris,150 mM Nacl,1%NP-40,0.5%sodium deoxycholate,0.1%SDS,pH 7.5. Phenylmethylsulfonyl fluor
17、ide(1 mM),1mg/ml leupeptin,1mg/ml aprotinin )置于冰上15 分钟,4离心(5min,5000rpm)后,收集细胞裂解后的上清液和浓缩的细胞培养液上清, 于80保存。利用 Bio-Rad 蛋白分析试剂盒(Bio-Rad 公司,美国)将样本的浓度调制至1mg/ml。1.2 方法1.2.1Western 杂交实验方法:即加入 20ug 样本于 15%聚丙烯酰胺平版凝胶中电泳,然后转移至 PVDF 膜(Bio-Rad),再加入 0.1%PBS/Tween-20 稀释的一抗后于 4下培养过夜9。漂洗后与 0.1% PBS/Tween-20 稀释(1:5000)
18、的辣根过氧化物酶二抗反应。以柯达成像胶片(Eastman Kodak 公司,美国)成像,化学发光法检测信号强度17。以 SW620 细胞和 DW(Drink Water, 蒸馏 水)的细胞裂解分别作为阳性及阴性对照。1101.2.2免疫荧光染色将非解离型胰腺癌细胞 PC-1 和 Capan-2 于载玻片上培养 36h。培养结束后,用前述方 法行免疫荧光染色5。即将上述细胞与 1:50 稀释的抗 claudin-1、抗 ocludin 或抗 ZO-1 抗体 培养过夜。上述细胞室温与若丹明标记的二抗反应 2 小时。计数后,用生物共焦激光扫描显 微镜(FV500-IX,Olympus 公司,日本)获
19、取图像。1151201.2.3体外侵袭分析利用 Invasion Chamber(侵袭小室,Becton Dickinson Labware 公司,美国)检验细胞的体 外侵袭能力。以 1ml 含 10%FBS 的 RPMI-1640 培养液作为化学诱导物,上层侵袭小室中加 入相同剂量 BALA/3T3 细胞的无血清培养液上清。将 500ul 含 10%FBS 的 RPMI-1640 培养 液上清(1105/ml)加入 Transwell 中。上述细胞和 10uM AG1478,10uM U0126 或 100ng/ml MMP-7 在 37条件下培养 12h 后,用拭子将过滤网的上层细胞拭去,
20、对迁移到滤膜下的细 胞进行固定并用 Diff-Quik 染色。然后于 100 显微镜下计数每 1mm2 网格上细胞核数目,以 确定滤膜下迁移细胞的数目。1.2.4免疫组化分析本实验利用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术5(Vectastain Elite ABC 试剂盒;精品论文125Vector Laboratories 公司, 美国)完成免疫组化实验。即切片与 1:200 稀释的抗 MMP-7 抗体在室温下培养 2 小时后,再与生物素(酰)化的二抗在室温下培养 50 分钟,然后和亲和素过 氧化物酶结合物培养 1h 后并清洗。最后,将切片与二氨基联苯和过氧化氢(Vector Laborto
21、ries)在室温下反应。清洗后,用苏木素复染色 3 秒。对照组的处理包括:a)切片不 用一抗处理。b)用正常羊血清和非特异性 IgG 代替抗 MMP-7 多克隆抗体。1.2.5数据分析用 Stat View 计算机软件(SAS Institute 公司,美国),利用非配对 Student,s t 检验检测 细胞外侵袭实验中胰腺癌细胞的数目。P0.05 差异具有显著性。2结果1301352.1 MMP-7 蛋白在胰腺癌细胞中的表达Western 杂交结果显示 MMP-7 在细胞中以前酶原的形式存在(仓鼠胰腺癌细胞中分子 量为 27kDa,人胰腺癌细胞中分子量为 28kDa)(图 1A 和 1C)
22、。仅在 PC-1.0 和 AsPC-1 细胞的培养基上清中检测出活化型 MMP-7 蛋白(仓鼠胰腺癌细胞分子量为 17kDa,人胰腺 癌细胞分子量为 18kDa)(图 1B 和 1D)。尽管在未处理的 PC-1 和 Capan-2 细胞培养基上 清中前 MMP-7 蛋白表达较强,但未检测出活化的 MMP-7 蛋白表达(图 1B 和 1D)。此外, AG1478(EGFR 抑制剂) 或 U0126(MEK 抑制剂)明显抑制上述胰腺癌细胞内及培养液上清中 MMP-7 的表达。140145150图 1. Western 杂交检测胰腺癌中 MMP-7 的表达注:AG1478 和 UO126 抑制胰腺癌
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