五味子多糖提取纯化及功能性研究硕士学位论文.doc
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1、硕士学位论文 五味子多糖提取纯化及功能性研究 Classified Index: U.D.C: Dissertation for the Master Degree in Engineering STUDIES ON EXTRACTION AND FUNCTIONALITY EFFECT OF THE POLYSACCHARIDES IN FRUCTUS SCHIZANDRAE 目录 I 学位学位论论文原文原创创性声明性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
2、对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: 日期: 年 月 日 学位学位论论文版文版权权使用授使用授权书权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定, 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名:日期: 年 月 日 导师签名: 日期: 年 月 日 东北农业大学工学硕士学位论文 II 目录 摘要摘
3、要. V Abstract.VII 1 引言引言 1 1.1 五味子的研究概况 1 1.1.1 五味子品种考证 2 1.1.2 五味子化学成份研究 2 1.1.3 五味子的功能 2 1.1.4 五味子在食品工业中的应用及其开发前景 5 1.2 多糖的研究概况 5 1.2.1 多糖的来源 6 1.2.2 多糖的生物活性 8 1.2.3 多糖的提取和纯化 10 1.2.4 目前多糖研究中存在的问题 12 1.3 立题意义及研究内容 13 2 材料与方法材料与方法 15 2.1 材料和仪器 15 2.1.1 原料 15 2.1.2 试剂 15 2.1.3 仪器设备 16 2.2 试验方法 16 2.
4、2.1 五味子多糖的提取工艺优化 16 2.2.2 五味子多糖的分级纯化 20 2.2.3 五味子多糖得抗氧化性研究 21 2.2.4 五味子多糖对人肝癌细胞 HepG2 细胞凋亡的影响. 22 3 结果与分析结果与分析 25 3.1 五味子多糖提取工艺参数的选择 25 3.1.1 提取次数对得率的影响 25 3.1.2 提取料液比对得率的影响 25 3.1.3 提取温度对得率的影响 26 3.1.4 提取时间对得率的影响 27 3.1.5 提取 pH 值对得率的影响. 28 3.1.6 影响提取得率各因素正交分析 28 3.1.7 响应面分析 29 3.1.8 参数选择 34 3.2 五味子
5、粗多糖纯化结果 34 3.2.1 醇沉处理效果 34 3.2.2 脱脂效果 35 3.2.3 复合法脱蛋白质效果 35 3.2.4 脱色与透析效果 35 东北农业大学工学硕士学位论文 3.2.5 苯酚硫酸法测五味子多糖的标准曲线 36 3.3 五味子多糖的分级纯化 36 3.3.1 DEAE-52 对五味子多糖的分级结果 36 3.3.2 Sephadex G-100 对 SP-2 和 SP-4 的层析结果 37 3.3.3 SP-2a 和 SP-4b 纯度鉴定. 37 3.4 SP-2 和 SP-4 的抗氧化性研究 38 3.4.1 SP-2 和 SP-4 对 DPPH清除试验 38 3.4
6、.2 SP-2 和 SP-4 对超氧自由基的清除试验. 39 3.5 SP-2 和 SP-4 对人肝癌细胞 HEPG2 增殖的影响 40 3.5.1 肝癌细胞 HepG2 的生长曲线. 40 3.5.2 五味子多糖 SP-2a 对肝癌细胞 HepG2 的抑制作用. 41 3.5.3 五味子多糖 SP-4b 对肝癌细胞 HepG2 的抑制作用. 43 3.5.4 形态学观察结果 44 4 讨论讨论 45 4.1 五味子多糖提取工艺的优化. 45 4.1.1 提取工艺优化 45 4.1.2 除杂工艺优化 46 4.2 五味子多糖纯化. 47 4.3 五味子多糖的抗氧化能力分析. 48 4.4 SP
7、-2a 和 SP-4b 对 HepG2 的影响 49 4.5 展望. 50 5 结论结论 51 5.1 确定了五味子多糖的最佳提取工艺. 51 5.2 五味子多糖的分级纯化. 51 5.3 SP-2a 和 SP-4b 的抗氧化研究 51 5.4 SP-2a 和 SP-4b 对 HepG2 凋亡影响 52 致致 谢谢 53 参考文献参考文献 54 攻读学位期间发表的论文攻读学位期间发表的论文 59 CONTENTS IV CONTENTS Abstract. V Abstract.VII 1 Introduction . 1 1.1 Research advance of fructus sch
8、izandrae. 1 1.1.1 Species research of fructus schizandrae 2 1.1.2 Chemical composition of fructus schizandrae 2 1.1.3 Function of fructus schizandrae 2 1.1.4 Fructus schizandrae was utilized in food industry and prospect 5 1.2 Research advance of polysaccharide 5 1.2.1 The source of polysaccharide 6
9、 1.2.2 The biological activities of polysaccharide. 8 1.2.3 Extraction and purification of schzandrea. 10 1.2.4 The problem of polysaccharide actuality 12 1.3 Research background and content 13 2 Materials and Methods. 15 2.1 Test materials and apparatus. 15 2.1.1 Raw materials 15 2.1.2 Chemical rea
10、gentes 15 2.1.3 Apparatuses . 16 2.2 Test methods. 16 2.2.1 Optimize extract technology of fructus schizandrae ploysaccharide 16 2.2.2 Isolation and purification of fructus schizandrae ploysaccharide. 20 2.2.3 Antioxygen ability of fructus schizandrae ploysaccharide. 21 2.2.4 Apoptotic HepG2 influen
11、ced by fructus schizandrae ploysaccharide 22 3 Results and Discussion 25 3.1 Extraction Process Condition of fructus schizandrae ploysaccharide 25 3.1.1 Effect of degree on yield diversity 25 3.1.2 Effect of volume on yield diversity. 25 3.1.3 Effect of temperature yield diversity. 26 3.1.4 Effect o
12、f time on yield diversity 27 3.1.5 Effect of pH on yield diversity 28 3.1.6 Orthogonality analysis. 28 3.1.7 Response surface analysis. 29 3.1.8 Preferences 34 3.2 Purification of fructus schizandrae ploysaccharide. 34 3.2.1 Effect of alcohol precipitation. 34 3.2.2 Effect of reduction of lipoid 35
13、3.2.3 Effect of reduction of protein 35 3.2.4 Efect of dialysis and reduction of colour. 35 3.2.5 The standard curve of phenol sulphuric acid 36 3.3 Fructus schizandrae ploysaccharide classified. 36 3.3.1 Fructus schizandrae ploysaccharide classified by DEAE-52. 36 3.3.2 SP-2 and SP-4 laminar analys
14、ised by Sephadex G-100. 37 3.3.3 SP-2a and SP-4b purity appraisement. 37 3.4 Antioxygenic activity of SP-2 and SP-4. 38 3.4.1 Test of scavenging DPPH with SP-2 and SP-4 38 3.4.2 Test of scavenging superoxide radical with SP-2 and SP-4 39 3.5 The effect of HepG2 proliferation with SP-2 和 SP-4. 40 3.5
15、.1 Growth curve of HepG2 40 3.5.2 The depressant effect for HepG2 with SP-2a 41 3.5.3 The depressant effect for HepG2 with SP-4b 43 3.5.4 The result of morphology observation 44 4 Discussion. 45 4.1 The optimized extractional technic for fructus schizandrae ploysaccharide. 45 4.1.1 The optimized ext
16、ractional technic . 45 4.1.2 The optimized technic of eliminate impurity 46 4.2 Purification of fructus schizandrae ploysaccharide. 47 4.3 Antioxygenic activity of fructus schizandrae ploysaccharide. 48 4.4 The effect of HepG2 proliferation of SP-2 和 SP-4. 49 4.5 Prospect. 50 5 Conclusions 51 5.1 Th
17、e optimized extractional technic for fructus schizandrae ploysaccharide. 51 5.2 Fructus schizandrae ploysaccharide classified 51 5.3 Antioxygenic activity of SP-2 and SP-4. 51 5.4 The effect of HepG2 apoptosis with SP-2 和 SP-4 52 Acknowledgement. 53 Reference 54 Published papers in the period of mas
18、ter degree education. 59 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得 (注:如没有其他需要特别声明的,本栏可空)或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允
19、许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 导 师 签 名: 日期: 年 月 日 摘 要 本研究以黑龙江产的北五味子为原料,对五味子多糖的提取方法,除杂工艺,多糖的 分级纯化及五味子多糖的功能性进行了研究。 五味子多糖提取工艺采用碱提醇沉。首先分析了温度、提取时间、液料比、提取次数、 pH 值等因素对总提取物得率的影响;然后把总提取物依次用索氏提取法脱除脂类,木瓜蛋 白酶法、Sevage 法与聚酞胺吸附三种方法联
20、用脱除蛋白质,H2O2脱色,透析,真空浓缩, 冷冻干燥,得五味子粗多糖,分析各单因素对五味子多糖得率的影响。再经 L16(45)正交 试验分析了五味子粗多糖得率,并用 SAS 软件对各因素做了响应面分析。统计分析得出最 佳提取工艺为:液料比 15、提取时间 50 分钟、提取温度 80、提取 3 次、提取 pH 值为 8.5。五味子粗多糖得率为 16.23%,比传统水提得率提高了 134.5%。提取次数和提取 pH 值 对提取得率有显著性(p五味子乙素五味子二醇,比抗氧化剂维生素 E 的作用强。对氧自由基的清除是这些成分抑制脂质过氧化的机理之一。五味子酚对阿霉素 半醒自由基信号无显著性影响,但对
21、其产生的 OH有显著抑制作用(黄治森等,1996) 。 1.1.3.4 对免疫功能的影响 用五味子粗多糖给小鼠按 100200mg/kg 多次灌胃,能明显提高小鼠的耐缺氧能力,具 有抗疲劳作用,亦能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量增加,并增强小鼠静脉注射胶体碳粒的 廓清速率。实验表明五味了粗多糖在升高白细胞的同时,可对抗环磷酰胺的免疫抑制作用, 使小鼠的胸腺和脾脏重量增加,说明五味子粗多糖可提高肌体的免疫力,增加肌体对有害 刺激的抵抗力,减轻肌体损伤(孙文娟等,2001) 。 l.1.3.5 抗衰老作用 环核苷酸(CAMP,CGMP)是细胞内第二信使,在生命活动调节和疾病发生发展中具 有重要作用,常
22、作为药物抗衰老作用的一种指标。用五味子喂养老年大鼠 2 个月,五味子 东北农业大学工学硕士学位论文 - 4 - 能显著提高心肌 CAMP 含量、CAMP/CGMP 比值,降低 CAMP 磷酸二酯酶活性(陈国千 等,1992) 。五味子浸出液能延缓小鼠大脑皮质毛细胞基膜增厚,降低毛细血管月增长率, 改善大脑皮质内的血液供应。通过小鼠寿命试验,给药组比对照组寿命显著延长。这说明 五味子确有延年益寿的作用(黄治森等,1990) 。 1.1.3.6 对心血管系统的影响 五味子有血管舒张作用,从五味子中分离出来的五味子素、戈米辛 A、B、C、D、G、H、J、N 等木脂素成分对由 PGF2 和 CaCl2
23、所引起的离体狗肠系膜动 脉收缩具有缓解作用。戈米辛 J 钠盐对于豚鼠离体心脏具有增加冠脉血流的作用。 1.1.3.7 对呼吸系统的影响 五味子煎剂静脉注射,对正常兔、麻醉兔和犬都有明显的呼吸兴奋作用,使呼吸加深 加快。并能对抗吗啡的呼吸抑制作用,中和其酸度,作用略减弱,酊剂亦有同样的结果。 呼吸兴奋的同时,血压显著下降。切除迷走神经和颈动脉窦区神经后,呼吸兴奋作用仍然 存在。由此认为其呼吸兴奋作用是对呼吸中枢直接兴奋的结果(末川守等,1987) 。对用香 烟熏吸造成小鼠慢性支气管炎,用五味子防治,结果表明,五味子对慢性支气管炎无明显 防治作用。但可降低动物死亡率,可使支气管上皮细胞内 RNA
24、增多,对支气管上皮细胞功 能有一定的增强作用(齐治等,1988) 。 1.1.3.8 抗菌的作用 五味子在体外有杀蛔虫作用。其乙醇浸提液在体外对炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、白 色葡萄球菌、副伤寒杆菌 A 和 B、肺炎杆菌、伤寒杆菌、志贺氏痢疾杆菌、异型痢疾杆菌、 霍乱弧菌、肠炎沙门杆菌、产气杆菌、变型杆菌等皆有抑制作用(王岳等,1994) 。五味子 也对红色毛菌、石膏样毛疾菌、大小孢子菌、猪小孢子菌、奥杜盎小孢子菌等都具有抑菌 和杀菌作用(赵晓洋等,1991) 。 1.1.3.9 对中枢神经的作用 五味子醇浸提物及五味子醇甲对中抠神经系统不但有安定作用,而且还有抗惊厥作用。 腹腔注射明显延长小鼠
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