植物组织培养褐变产生的因素及对策 毕业论文.doc
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1、装订线植物组织培养褐变产生的因素及对策摘要 简要说明了植物组织培养中褐变的危害,分析了褐变产生的机理及影响因素,详细阐述了抑制褐变的若干措施。关键词 植物组织培养 褐变 酚类物质 多酚氧化酶醌类物质Abstract Briefly explain the plant tissue culture in the dangers of Browning, analyzes the Browning emergence mechanism and affecting factors, this paper expounds the inhibition of Browning measures.Ke
2、ywords plant tissue browning phenol polyphenol oxidase quinoid substances在许多植物组织培养过程中,常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体,在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐,而且对许多酶有抑制作用,从而影响培养材料的生长与分化,严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施,对我们进行科学研究或工厂生产,包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。1 褐变的危害褐变是指外植体在培养
3、过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物,尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物,这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在,因而比较稳定。在切割外植体时,切口附近的细胞受到伤害,其分割状态被打破,酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲,酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应,可诱导植保素或无物理屏障的形成,以防止微生物浸染组织。但酚类很不稳定,在溢出过程中与多酚氧化酶接触,在多酚氧化酶的催化下,迅速氧化成褐色的醌类物质和水,醌类物质
4、又会在酪氨酸酶等的作用下,与外植体组织中的蛋白质发生聚合,进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱,生长停滞,最终衰老死亡。此外,由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。2 褐变产生的机理2.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡,即坏死形成的褐变现象,并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等1将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中,组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变,但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长,也会发生此类现象2。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生
5、了3。2.2 酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的,培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的4。酶促褐变如同一般的酶促反应,其发生必须具备三个条件,即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看,表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物,按其组成可分成3类:苯基羧酸,苯丙烷衍生物,黄烷衍生物,但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变,是因为在正常的组织细胞内由于
6、多酚类物质分布在细胞的液泡内,而PPO则分布在各种质体或细胞质中,这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时,则为酶创造了与PPO接触的条件,在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌,进行一系列的脱水、聚合反应,最后形成黑褐色物质,从而引起褐变。3 褐变产生的影响因素影响植物组织培养褐变的因子是复杂的,因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同,褐变的程度也有所不同。3.1 植物种类及基因型 在不同植物或同种植物不同基因型的组培过程中,褐变发生的频率和严重程度存在很大的差异,这是由于各种植物所含的单宁及其他酚类化合物的数量不同。一般木本植物的酚类化合物含量比草本植物
7、高,更易发生褐变现象。核桃的单宁含量很高,不仅在接种初期发生褐变,在形成愈伤组织后还会因为褐变而死亡;苹果进行茎尖培养时,不同品种之间褐变的程度也不一样。对葡萄的研究也发现类似情况。3.2 外植体的生理状态 外植体的生理状态不同,接种后褐变程度不同。一般外植体的老化程度越高,其木质素的含量也越高,也就越容易褐变,成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。另外切口越大,酚类物质的被氧化面也越大,褐变程度就会更严重。因此外植体的受伤程度对褐变的产生具有明显的影响,伤口加剧褐变的发生。仙客来小叶诱导时,整片叶接种较分成多块褐变要轻。除机械损伤外,各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变,对于不易褐变的种类,用升
8、汞消毒后,一般不会引起褐变,若用次氯酸钠进行消毒,则很容易引起褐变的发生。3.3 取材时间和部位 在不同的生长季节,植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。实验表明在苹果和核桃上,冬、春季取材褐变死亡率最低,夏季取材很容易褐变。在取材部位上幼嫩茎尖比其他部位褐变程度低,木质化程度高的节段在进行药剂消毒处理后褐变现象更为严重。3.4 培养基 在初代培养中,培养基中无机盐浓度过高,会引起酚类物质大量产生,导致褐变。BA和KT不仅促进酚类化合物合成,而且刺激多酚氧化酶的活性,增加褐变;而生长素类如NAA和2,4-D可延缓多酚合成,减轻褐变。采用液体培养基纸桥培养;可使外植体溢出的有毒物质很快扩
9、散到液体培养基中,效果也很好。3.5 光照在采取外植体前,如果将材料或母株枝条进行遮光处理,然后再切取外植体培养,能够有效地抑制褐变的发生。将接种后的初代培养材料在黑暗条件下培养,对抑制褐变发生也有一定的效果遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中,许多反应受酶系统控制,而酶系统活性受光照影响。但是,暗培养时间过长会降低外植体的生活能力,甚至引起死亡。3.6 温度高温促进酚氧化,培养温度越高,褐变越严重,而低温可抑制酚类化合物氧化,降低多酚氧化酶的活性,从而减轻褐变。在15-25下培养卡特兰,比在25以上时褐变要轻,在17以下培养天竺葵茎尖比在17-27褐变要轻。3.7 培养时间材料培养时间过长
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