毕业设计(论文)-富油微藻的诱变与遗传转化.doc
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1、毕业设计说明书(论文) 作 者: 学 号: 09041501160904150116 院 系: 化学工程学院化学工程学院 专 业: 生物工程生物工程 题 目: 富油微藻的诱变与遗传转化富油微藻的诱变与遗传转化 指导者: 副教授 评阅者: 2013 年 6 月 吉 林 摘 要 I 摘摘 要要 温室效应与石化能源紧缺已成为全球问题,生物燃料作为一种可再生且环境 友好型的替代能源受到人们的广泛关注。不少微藻含油量高,环境适应能力强, 净碳值几乎为零,尤其是生物柴油最重要的原料来源之一。本论文对高油脂微藻 藻种筛选、高密度培养,实验中利用了苏丹黑染色法将藻细胞染色,在645nm波长 光下测量吸收峰并进
2、行比对,最高的吸收峰值即可得出藻种富油最佳的培养基, 即富油微藻的最优代谢生长环境条件;同时利用酸热萃取法提取测量该最优富油 环境下藻细胞中含油量为38.16mg/g。 通过本课题实验,会对提高微藻生物柴油的经济性提出一条极有可能实现工 业化的潜在高效的生产途径。 关键词关键词 生物柴油 富油微藻 代谢条件 苏丹黑染色法 酸热萃取法 Abstract II Abstract The greenhouse effect and petrochemical energy shortage has become a global issue, biomass as a renewable and e
3、nvironmentally friendly alternative energy attention. A lot of microalgae with high oil content, strong adaptive capacity to environment, net carbon value is almost zero, it is the most important source of biodiesel. In this paper, the high oil microalgae screening, high density culture, the Sultan
4、black staining the algae cell staining, measuring the absorption peak and compared in the 645nm wavelength, the maximum absorption peak to the medium of algal oil rich best, that is the optimal metabolic oil-rich microalgae growth condition at the same time, the optimal extraction; measurement of oi
5、ly algae oil environment for 38.16mg/g by using acid hot extraction method. Through the experiment, put forward a potentially efficient production way is very likely to achieve industrialization to improve the economy of microalgae biodiesel. KeyKey wordswords Biodiesel; Oil-rich microalgae; Metabol
6、ic conditions; Sultan black staining; Acid hot extraction method 目 录 III 目 录 摘摘 要要I ABSTRACT.II 目 录.III 第 1 章 绪 论.1 1.1 课题研究背景 1 1.1.1 研究项目背景1 1.1.2 微藻固定 CO2 及与油脂代谢的关系 2 1.1.3 基因工程技术微藻脂类代谢途径2 1.1.4 基因工程方法改造微藻3 1.2 课题研究目的和意义 5 1.3 国内外研究现状和发展趋势.5 1.4 主要研究内容与技术路线 .9 1.4.1 主要研究内容.9 1.4.2 实验中可能遇到的困难和解决办法
7、.9 1.4.3 采用的技术路线.9 第 2 章 实验材料和方法.11 2.1 实验材料.11 2.1.1 藻类培养基的配制方法11 2.2 微藻藻种采集分离纯种培养及保存方法 12 2.2.1 藻种采集及富集培养12 2.2.2 藻种的分离13 2.2.3 藻种的纯化培养14 2.2.4 藻种的保藏14 2.3 筛选获得实验藻类.15 2.4 实验流程.15 2.4.1 接种15 2.4.2 不同代谢条件驯化16 2.4.3 苏丹黑染色16 目 录 IV 2.4.2 苏丹黑 B 染色液的配制.16 3.2.3 染色后微藻细胞的吸光值与油脂含量17 2.4.4 测量含油量18 第 3 章 不同
8、碳氮比下培养微藻产油结果.19 3.1 不同代谢条件驯化.19 3.2 苏丹黑 B 染色测微藻油脂20 3.3 不同碳氮比条件下微藻吸光度数据 21 3.4 实验数据分析.22 第 4 章 微藻富油脂化培养的初步探讨.23 结 论.24 参考文献.25 致 谢28 东北电力大学本科毕业设计说明书(论文) - 1 - 第第 1 章章 绪绪 论论 1.1 课题研究背景 1.1.1 研究项目背景 能源是国民经济可持续发展的动力,是现代工业的支柱。现今石化燃料资源 日益枯竭给全球经济发展带来危机,其燃烧产物 CO2造成的温室效应也给全球环 境敲响警钟,人们逐渐开始寻求替代能源。生物质能是地球上最普遍的
9、一种可再 生能源,它通过植物光合作用将太阳能,以化学能形式储存在生物体内,被称为 绿色能源。现今欧洲国家广泛使用的生物柴油便是一种生物质能,其原料主要来 自高油脂农作物,如大豆、葵花籽等,但它们都存在产量低、成本高、经济性差、 与其他农作物争夺土地等缺点,所以在原料的选择上应更加审慎和全面考虑。 藻类,尤其微藻,能有效利用太阳能,将 H2O、CO2和无机盐转化为有机资 源,在能量转化和碳循环中十分重要。微藻富含蛋白质、脂肪、糖以及氨基酸、 高不饱和脂肪酸等多种生物活性物质,是人类向海洋索取食品、药品、精细化工 产品等重要材料的一把金钥匙。就全球来说,微藻是巨大的可再生资源,同时也 是生物燃料的
10、重要来源。微藻可生产几种生物燃料:一些微藻富含类似矿物油的烃 类物质,可加工成汽油、柴油使用1;利用微藻生物质厌氧消化可以生产甲烷等 气体燃料2;一些蓝藻和绿藻能在特定条件下通过光合作用产氢3;另一些微藻能 将光合产物转化成油脂储存在细胞质中,该油脂与高等植物油相似,都属甘油三 酯(TAG,又称中性脂,油脂),可加工转化为含硫量、黏度及熔点较低的酯类,如 脂肪酸甲酯(C14C22),即生物柴油4。微藻具有光合效率高,零净碳值,易培 养,生长周期短,油、烃含量高等优点5,并且“不与农争地,不与人争粮” ,不 影响全球能源分配,其作为生物能源,已引起各国政府和学者的高度关注。 东北电力大学本科毕业
11、设计说明书(论文) - 2 - 1.1.2 微藻固定 CO2 及与油脂代谢的关系 自养微藻以 CO2为碳源,了解微藻固定 CO2及其与油脂代谢的关系,采用基 因工程尽可能将 CO2转化为油脂,达到固碳和产油双重功效,成为基因工程的研 究方向。 还原戊糖磷酸途径(C3 途径)、双羧酸途径(C4 途径),景天酸代谢途径(CAM 途径)、是植物的三大光合碳代谢途径。其中,C3 途径较简单较古老,是大多数植 物的碳固定机理;C4 和 CAM 途径则比较复杂,一般只在一些高度进化的植物中出 现,没有 C3 途径广泛,尤其 CAM 机理只存在于仙人掌等耐旱植物中。微藻为低 等单细胞生物,被认为普遍依靠 C
12、3 途径,现在仅在 Phaeodactylum tricornutum 等 少数硅藻中发现了 C4 途径存在的证据。C3 循环中,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶催 化核酮糖-1,5-二磷酸固定 CO2,生成 3-磷酸-甘油酸,该分子也是糖酵解的中间 体,可进一步生成油脂。这个酶催化反应是光合作用碳固定以及油脂合成过程中 关键的限速步骤,因此核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶是该过程的重要调节酶6,采 用 GE 使核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶高效表达,很可能会提高微藻固定 CO2和油脂 积累能力。 1.1.3 基因工程技术微藻脂类代谢途径 油脂生物合成是生物界广泛存在的多酶催化过程,属初级代谢的一部分。
13、微 藻大多为真核细胞,其产油脂的过程,本质上与动植物产油脂的过程相似,细胞 中油脂生物合成路径如图 1 所示,由两个主要步骤组成:脂肪酸生物合成和油脂生 物合成。 脂肪酸生物合成 脂肪酸生物合成是油脂生物合成的基础过程,如图 1-1 中间虚线框所示,起始 于乙酰 CoA 羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase,ACCase)催化乙酰 CoA 转化为 丙二酰 CoA,然后脂肪酸合酶(fatty acidsynthetase,FAS)便以丙二酰 CoA 为底物 进行连续聚合反应。丙二酰 CoA 转移到 FAS 的亚基,即酰基载体蛋白(acyl-carrier 东北电力大
14、学本科毕业设计说明书(论文) - 3 - protein,ACP),与 ACP 上的硫醇基团形成硫酯产生丙二酰 ACP;同样,乙酰 CoA 也与 ACP 形成乙酰 ACP,再转移到 FAS 上形成乙酰合酶。丙二酰 ACP 与乙酰合 酶经 FAS 的另一个亚基,即 -酮酰-ACP 合酶催化缩合形成乙酰 ACP,随后经过 羰基还原、脱水、还原三步连续反应形成丁酰 ACP。丁酰 ACP 取代乙酰 ACP,与 丙二酰 ACP 缩合,进入第二轮碳链延伸。这个循环不断重复,以每次循环增加两 个碳的频率延长碳链,直到形成碳 16 或碳 18 的碳链,最后脂酰 ACP 硫酯酶切掉 酰基链,释放脂肪酸7。 油脂
15、生物合成 油脂在微生物细胞内以脂滴或脂肪粒形式储存于细胞质中8。油脂是以甘油- 3-磷酸(glycerol-3-phosphate,G3P)和脂酰 CoA 为主要前体。如图 1-1 下部虚线框 所示,首先 G3P 和脂酰 CoA 在甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-sn-3-phosphate acyl-transferase,GPAT)作用下酰化形成溶血磷脂酸,然后在溶血磷脂酸酰基转移 酶(lysophosphatidate acyl-transferase,LPAT)作用下与另一个脂酰 CoA 进一步酰化 形成磷脂酸,再由磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acidphosp
16、hatase,PAP)催化去磷酸化 形成甘油二酯,最后二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyl-transferase,DGAT) 催化将第三个脂酰 CoA 加到甘油二酯分子上形成油脂9。参照图 1-1。 1.1.4 基因工程方法改造微藻 乙酰 CoA 羧化酶(ACCase) ACCase 乙酰 CoA+CO2+H2O+ATP丙二酰 CoA+ADP+Pi (1) 二酰基甘油酰基转移酶(DGAT) DGAT 甘油二酯+脂酰 CoA甘油三酯+CoA (2) 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) PEPC 丙酮酸+CO2+H2O+ATP草酰乙酸+ADP+Pi (3) 东北电力大学本
17、科毕业设计说明书(论文) - 4 - CO2储存 CO2 葡萄糖 C3 系统 糖酵解 甘油醛-3-磷酸 糖酵解 磷酸烯醇丙酮酸盐(或酯) PEPC 苹果酸盐(或酯) ME 丙酮酸盐(或酯) 草酰乙酸盐(或酯) 醋酸盐;醋酸酯 ACS 乙酰辅酶 A ACL 柠檬酸盐 ACCase 乙酰磷酸酶 丙二酰辅酶 A 乙酰合成酶 FAS 丙二酰 ACP 乙酰乙酰基 ACP 脂肪酸的生物合成 酮酰 ACP 脂肪酸 3-磷酸甘油 反应 GPAT 脂肪酰基辅酶 A LISO 磷脂酸 LPAT 磷脂酸 TGA 的生物合成 PAP 甘油二酯 DGAT 三酰基甘油 图 1-1 微藻脂肪酸和油脂生物合成途径 东北电力大
18、学本科毕业设计说明书(论文) - 5 - 1.2 课题研究目的和意义 化石能源危机与二氧化碳排放已成为人类的两大难题,生物柴油是环境 友好的可再生替代能源。在其原料中,藻类油脂产率高且容易培养,被认为 是潜在的最佳生物柴油原料之一。国内外学者经过选育、诱变,获得了含油 量达到 2060%的微藻菌株;然而大多数微藻含油量并不高,为进一步提高含 油量,尤其是适合低温生长的本地微藻。 通过诱变与遗传转化等手段提高本地微藻菌株的产油量。尤其是在对营 养条件和培养条件的代谢途径优化方法上着手,会大大提高微藻在产油环节 上的产油率。通过本课题实验,我们相信这会对提高微藻生物柴油的经济性 提出一条极有可能实
19、现工业化的潜在高效的生产途径。 1.3 国内外研究现状和发展趋势 除了基因工程改造藻种,通过对营养条件和培养条件进行优化,也可引导细 胞代谢进入脂合成过程,从而实现微藻高产油。 表 1 显示了一定培养条件下不同微藻的生长和产油情况,以及氮浓度、温度、 通气等对藻生长和产油的影响。 实际生产中可以通过改善培养条件使产油率达到最高,如表 1 所示采用葡萄 糖异养 Chlorella protothecoides,藻的生长速度快、油含量高,产油率最高可达 3 679.1mgL1d110,远超过其余几种培养结果; 但异养微藻消耗葡萄糖等有机碳源,成本较高,并且释放 CO2,不能转化太 阳能和利用空气中
20、 CO2。如表 1 所示,氮源种类、氮源浓度、盐浓度、铁离子浓 度和光强等都会影响细胞内油脂积累。 黄建忠等3发现 NH4NO3、尿素等适合细胞生长但不适合油脂合成;蛋白胨、 牛肉膏不适合细胞生长但利于油脂合成;酵母膏不仅适宜细胞生长,也是油脂合成 的最佳氮源。 Li 等11研究了氮源种类和浓度对 Neochloris oleoabundans 细胞生长和脂积累 东北电力大学本科毕业设计说明书(论文) - 6 - 的影响,硝酸盐、氨、尿素是最普遍的氮源形式,其中 NaNO3是该藻生长和脂积 累的最适氮源,脂含量、脂产率、生物质产率分别出现在 NaNO3浓度为 3mM、5mM 和 10mM 时。
21、 Takagi 等12在高盐条件下培养 Dunaliella,当初始盐浓度从 0.5M 增至 1M 时,含油量由 60%增至 67%;当初始盐浓度为 1M,并在对数期中期或末期加入 0.5M 或 1M 盐时,含油量可增至 70%。 刘志媛等13在高浓 Fe3+条件下培养 Chlorella vulgaris,改变了藻株的代谢途 径,使油脂出现两次积累高峰,含油量提高了 7 倍,达细胞干重的 56.6%,并且高 Fe3+浓度对藻株生长影响不大。 台湾成功大学 Wu 和 Hsieh14采用嵌有透明隔间的敞口槽来自养培养 Nannochlorosis oculata,在最适的盐度、氮源和光强下油脂含
22、量达 60%,比传统的 分批培养增加了 76%。 研究发现能源、碳源充足而其他营养成分(如氮、硅、磷)胁迫可诱导某些微藻 积累油脂,其中氮是报道最多的营养限制因子。虽然处于“饥饿”状态的大部分 微藻积累油脂,但此时藻体生长缓慢,导致产油率下降,实际生产中要使产油率 最高,必须在微藻总生物量和细胞油脂含量间寻求平衡。 营养成分胁迫诱导微藻积累油脂的可能原因是:氮是细胞大分子(如酶、膜)或 细胞结构的成分,硅是硅藻细胞壁组成成分,氮硅胁迫使细胞分裂和增殖受到抑 制,并且营养限制时细胞对碳的同化将更多地流向脂肪,其他非脂类成分也会逐 渐向脂肪转化,油脂积累;磷对细胞能量的生物转化相关过程(如光合磷酸
23、化)非常 重要,光合作用需大量蛋白,蛋白合成需要富含磷的核糖体,磷胁迫使光合作用 受限,细胞代谢将倾向于脂合成。微藻产油脂可分为两个阶段,即藻体增殖期和 油脂积累期,这两个阶段对营养盐要求不同。 东北电力大学本科毕业设计说明书(论文) - 7 - 表 1-1 不同培养条件下部分微藻的产油脂情况 种类培养条件 生物生产力( mgL1 d1) 脂质 含量 (%) 生物生产力( mgL1 d1) 参考 10%CO226.55215.5165 bottyococcus 藻 5.5% CO2废气772420.65 足够的氮412510.2511 低氮363412.24 足够的氮27.9298.0910
24、Chlorella emersonii 低氮79.36349.96 足够的氮32.93110.2 微小小球藻 低氮15.7578.95 杜氏盐藻高盐506733.560 半连续自养49730.415123 在 15自养61.114.929.1171 在 20自养126.77.910.01 在 25自养72.713.8910.1 微绿球藻 自养在 20/还 原氮含量 75% 103.515.8616.41 Neochloris oleoabundans 硝酸钠作为氮源4003413359 Pleurochrysis carterae 户外滚道池塘长 期培养 1903362.721 10%CO22
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