靶向MRP1基因pRNAT-H1.1以及shuttle-RFP重组质粒表达载体构建_毕业设计论文.doc
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1、齐 齐 哈 尔 大 学毕业设计(论文)题 目 靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体构建学 院 专业班级 学生姓名 指导教师 成 绩 2011 年 6 月 20 日齐齐哈尔大学毕业设计(论文)摘 要癌症严重威胁着人类的健康,其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段,在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂,多药耐药相关蛋白1(Multidrug Resistance-associated Protein
2、1,MRP1)的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术,如能通过RNAi技术沉默MDR1基因,逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。目的:本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。方法:将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接,构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5后大
3、量提取重组质粒,经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。结果:成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。 关键词:RNA干扰;MRP1;pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒;穿梭载体 AbstractCancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, whi
4、ch is an irreplaceable way in cancer treatment. MDR of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively complicated, and the excessively expression of multidrug resistance-associated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing
5、MDR1 gene by RNAi, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR.Objective: In this study, pRNAT-H1.1/shuttle-RFP plasmid was selected to construct the RNAi expression vector of mrp1 mRNA.Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned
6、 into pRNAT-H1.1/shuttle-RFP vector to construct recombinant vector. Transformed the recombinant vector into E.coli DH5. The result of recombinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing .Results: Constructing pRNAT-H1.1/shuttle-RFP recombinant plasmid expression vector was c
7、onstructed successfully. It may be the foundation of restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells.Key Words:RNA interference;MRP1;pRNAT-H1.1/shuttle-RFP plasmid;shuttle vector目 录摘 要IAbstractII第1章 绪 论11.1 RNAi的研究进展11.1.1 RNAi的发现过程11.1.2 RNAi的分子作用机制21.1.3 RNAi的特点31.1.4 siRNA简介31.1.5 siRNA的设计原则
8、31.1.6 RNAi在抗肿瘤方面的研究41.2 用于RNAi的载体41.2.1载体的选择51.2.2 质粒人工构建的目的51.3 MRP1的研究进展51.3.1 MRP的转运底物、组织分布及生理作用61.3.2 MRP在组织中的表达61.4 基因治疗71.5 本课题在国内外的研究现状71.6 本论文的研究目的及意义81.7 本论文的主要内容8第2章 实验材料与方法92.1 实验材料92.1.1 宿主菌92.1.2 质粒载体92.1.3 载体通用引物112.1.4 主要试剂及工具酶112.1.5 主要仪器122.2 实验方法132.2.1 shRNA的设计与退火132.2.2 合成干涉片段的退
9、火162.2.3 重组载体的构建172.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子202.2.5 测序鉴定重组载体212.2.6 重组质粒大提的OD值检测21第3章 结果与分析223.1 质粒经Hind和BamHI双酶切后胶回收结果223.1.1 质粒经Hind和BamHI双酶切后结果223.1.2 目的片段的回收233.2 重组载体的菌落PCR243.3 重组质粒大量提取253.4 重组质粒测序结果26讨 论294.1 菌落PCR鉴定重组294.2 重组质粒穿梭载体的构建29结 论30参考文献31致 谢3431齐齐哈尔大学毕业设计(论文)第1章 绪 论1.1 RNAi的研究进展RNA干扰(RNA i
10、nterference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程,为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具,在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。1.1.1 RNAi的发现过程1990年,Rich Jorgensan 和他的同事在对矮牵牛花进行实验时,无意中发现一种奇怪的现象。他们尝试把pigment-produing这种由强有力的启动子控制的基因导入矮牵牛花以加深花的紫色,结果却发现不但颜色未加深,许多花呈现杂色甚至白色。Rich Jorgensan 把这
11、种现象称为共同抑制,因为导入了外源性基因,使得和内源性基因具有相似功能的基因的表达都被抑制了1。遗憾的是当时这种现象并未引起Jorgensen 的重视。1994年,Cogoni2和Macino采用粗糙脉胞霉进行转基因研究时,发现真菌中也存在类似的现象,他们称之为基因抑制,这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。1995 年 Guo3 等在对线虫的实验中发现,正义 RNA 与反义 RNA 一样可以阻断par21 基因的表达,可惜作者同样对这一现象也没有更深入的研究,只做了普通的报道。直到 1998年,关于 RNAi 现象的研究才被人们真正的发现4。Fire5等将双链 RNA,即正义链和反义链的混合
12、物,注射到线虫的体内,却诱发了比正义链或反义链的单独注射效果更强的基因沉默,要彻底使同源基因的表达沉默,在每一个细胞中,只需要很少的几个分子的双链就可以做到。在接下来进行的实验中还证实6,将双链RNA注入线虫体内后 ,不但阻断了线虫体内所有同源基因的表达,同时还沉默了其第 1 代子代的同源基因,他们从此把这种现象命名为 RNAi。随后,RNAi 现象又陆续在果蝇、锥形虫、真菌、涡虫、植物及斑马鱼等真核生物的研究中被发现7。这种情况揭示了RNAi现象可能出现于生命进化的早期阶段,在RNAi机制发现之前,不同生物中的RNAi现象有着不同的描述:真菌中称为“镇压”作用,在植物中被称为转录后基因沉默和
13、基因协同抑制 8。1.1.2 RNAi的分子作用机制RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同,但是主要可以分为两种类型:特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA(2123nt)上,非特异性效应发生于长双链RNA(30nt以上)。9。其中,RNAi的特异效应作用机制是在多个不同的水平上实现的,包括翻译水平、转录水平、转录后水平等。其中,转录后水平RNA干扰的研究最为深入,应用也最为广泛。101.1.2.1 特异性效应转录后水平的RNA干扰的发生机制是在对果蝇、线虫等生物体进行科学研究从而进一步推导得出来的。随着科学
14、技术的发展和RNAi研究的深入,人们对RNAi的作用机制的了解也越来越多,通过生化和遗传学研究,现在普遍认为RNAi可能的作用机制主要包括两个阶段:第一步:起始阶段,即内源或外源dsRNA经特定的RNase III 家族的双链特异的核糖核酸酶(Dicer) 以ATP 依赖的方式将长的dsRNA 切割成2123 nt的小干扰RNA;第二步,效应阶段,即siRNA与RNA诱导沉默复合物RISC结合共同降解靶mRNA11。除此之外还有某些研究认为RNAi的作用机制还存在着第三阶段循环放大阶段。这是RNAi的自身循环放大机制,其机制主要是指在效应阶段,RISC活化后与mRNA结合,mRNA被内切核酸酶
15、切割成大小在l223nt不等的小片段,这些片段可以特异性地阻碍表达靶基因。同时,释放出来一种可以作为特殊引物的siRNA,从而以靶mRNA为模板在RdRP的作用下,合成新的dsRNA。这种dsRNA可以降解成新的siRNA,在这个循环中表现出放大效应 10。抑制相应mRNA的翻译可阻碍相应的蛋白质表达,这就是翻译水平的RNA干扰机制12,其中stRNA起到了非常的重要作用。转录水平上的RNA机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用,从而加强同源DNA的甲基化,以阻碍目的基因转录,使表达关闭,从而强化基因沉默。有文献谈到组蛋白H3及相应DNA区域可被dsRNA诱导甲基化。一旦启动子区域出现
16、甲基化,那么转录将被阻断,如编码区出现甲基化,则可以进行转录,但在转录后水平上沉默。1.1.2.2 非特异效应研究表明,长度大于30nt的长双链RNA转染至哺乳动物体内,dsRNA会激活双链RNA所依赖的蛋白激酶途径13,从而导致EIF-2因子磷酸化,进而非特异性地抑制翻译,诱发全面的细胞基因沉默。1.1.3 RNAi的特点RNAi具有高效性,也就是说与细胞内的mRNA的量相比,注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在,仍可以有效地阻断目的基因的表达;同时,RNAi也具有高特异性,小干扰RNA由dsRNA降解得到的,除在序列识别中不起主要作用的正义链3端的两个碱基以外,其余
17、碱基均为必需。任何单个碱基的改变即导致RNAi失效,RNAi能特异性降解mRNA,针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活。除此之外,RNAi还具有共抑制性、种属时效性和dsRNA的长度限制性的特点。1.1.4 siRNA简介RNA干扰作用是通过siRNA(small interfering RNA,siRNA)这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明,双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合,进而降解mRNA。RNaseIII核酶家族的Dicer是RNA干扰中一个非常重要的酶。它可以结合到dsRNA上,并剪切其成为212
18、3nt且3端突出的小分子RNA片断,形成siRNA。141.1.5 siRNA的设计原则RNAi 作用的成功与否,关键在于siRNA序列的结构,不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大, 2001年,Elbashir S M等15应用化学合成法合成了siRNA,并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi,他们进而据此提出了siRNA 设计方法:1) 从起始密码下游50100nt开始搜索siRNA以避免出现于5或3端的UTRs 的蛋白结合位点,;2)搜索5AA(N19)UU序列,如果没有相应序列,可以选择5AA(N21)或5NA(N21);3)G/C含量在32%79%之间16; 4) 要确定siR
19、NA对靶基因的特异性,可以利用Blast软件在基因组中进行比对,;5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是,Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低,要更好的掌握RNAi,提高效率,理性设计siRNA有效序列成为siRNA 研究的重要方向。目前, 影响siRNA功能的因素包括siRNA序列的结构特点,靶mRNA的空间结构RISC与siRNA的相互作用,以及siRNA与mRNA错配等17。1.1.6 RNAi在抗肿瘤方面的研究目前对肿瘤的治疗手段主要有药物化学治疗、手术切除和放射治疗,这些治疗方法均无法做到特异性地杀伤及完全根除肿瘤,而且副作用较大。
20、RNAi 具有特异性、简易性及高效性的特点,可稳定沉默突变基因,而对正常基因的表达不产生影响,在肿瘤的研究及治疗上有着无法比拟的优势。随着 RNAi 技术的不断成熟,肿瘤的研究有了空前突破,研究的重点主要在有关肿瘤免疫逃逸、肿瘤性疾病信号传导的途径、癌基因及抑癌基因的敲除、提高肿瘤对化疗及放疗的敏感性等方面18。1.2 用于RNAi的载体基因工程中,携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具,称为载体。是指能够运载外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞,具有自我复制能力,使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达,不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能:(1)运送外源
21、基因高效转入受体细胞;(2)为外源基因提供复制能力或整合能力;(3)为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。目前使用的已知载体除了大肠杆菌中的质粒、噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外,还有酵母、细菌人工染色体载体以及动、植物病毒载体等19作为基因工程中使用的载体必须具备以下条件:(1)有复制起点,在受体细胞中能自我复制,或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制;(2)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;(3)具有筛选转化子的选择性标记基因;(4)分子量小,拷贝数多;(5)具有较高的外源DNA的载装能力;(6)安全,不含对受体细胞有害的基因,不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。载体
22、按其应用范围,可以分为克隆载体和表达载体。克隆载体是指用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体是指使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞,使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。1.2.1载体的选择质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传,并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。构建的质粒载体与天然质粒相比通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因),同时可能带有多个
23、人工合成的单一限制性内切酶识别位点。但是,天然质粒的缺点是分子量大,拷贝数低,所以为使分子量尽可能减少,必须去掉大部分的非必需序列,以便于基因工程操作。20除此之外,质粒载体一般还带有一些可以进行体外转录外源DNA、鉴定片段的插入方向等用途的序列。21细菌质粒是独立于细菌染色体的自主复制的环状双链DNA分子,只有酵母的杀伤质粒已知是RNA分子。环状双链DNA分子有三种构型。包括两条链的环状结构都保持完整的呈超螺旋构型的共价闭合环状DNA(cccDNA),双链中有一条链环状结构完整,只在另一条单链上有切口的开环DNA(ocDNA)以及双链断裂呈线状的线状DNA22。在琼脂糖凝胶电泳时,同种质粒的
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