第八章高效液相色谱分析.ppt
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1、第八章 高效液相色谱分析,第一节 特点与分类,一、特点: 高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,第二节 高效液相色谱法的主要类型及基本原理,一、液-固吸附色谱(liquid-solid adsorption chromatography) 固 定 相:固体吸附剂为,如硅胶、氧化铝等,较常使用的是5 10m的硅胶吸附剂。 流 动 相:各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理:组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸; 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点:非线形等温吸附常引起峰的拖尾。,二、液-液分配色谱(liqui
2、d- liquid partition chromatography),固定相与流动相均为液体(互不相溶); 基本原理:组分在固定相和流动相上的分配; 流 动 相:对于亲水性固定液,采用疏水性流动相,即流动相的极 性小于固定液的极性(正相 normal phase),反之,流 动相的极性大于固定液的极性(反相 reverse phase)。 正相与反相的出峰顺序相反; 固 定 相:早期涂渍固定液,固定液流失,较少采用; 化学键合固定相:(将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 (担体)表面的游离羟基上。C-18柱(反相柱)。,三、离子交换色谱(ion-exchange chromatograph
3、y),固 定 相:阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂; 流 动 相:阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离子离 子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液; 基本原理:组分在固定相上发生的反复离子交换反应;组分与离子交换 剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大,保留时间长; 阳离子交换:RSO3H+M+=RSO3M+H+ 阴离子交换:RNR4OH+X-=RNR4X+OH- 应 用:离子及可离解的化合物,氨基酸、核酸等。,四、离子色谱(ion chromatography),离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术, 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的
4、、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料,并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器,是测定混合阴离子的有效方法。 有关内容将在第十章第六节中讲授。,五、离子对色谱(ion pair chromatography),原理:将一种(或多种)与溶质离子电荷相反的离子(对离子 或反离子)加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物,使其能够在两相之间进行分配; 阴离子分离:常采用烷基铵类,如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对离子; 阳离子分离:常采用烷基磺酸类,如己烷磺酸钠作为对离子; 反相离子对色谱:非极性的疏水固定相(C-18柱),含有对离子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相,
5、试样离 子X-进入流动相后,生成疏水性离子对Y+X - 后;在两相间分配。,六、排阻色谱色谱 (size- exclusion chromatography),固定相:凝胶(具有一定大小孔隙分布); 原 理:按分子大小分离。小分子可以扩散 到凝胶空隙,由其中通过,出峰 最慢;中等分子只能通过部分凝 胶空隙,中速通过;而大分子被 排斥在外,出峰最快;溶剂分子 小,故在最后出峰。 全部在死体积前出峰;可对相对分子质 量在100-105范围内的化合物按质量分离。,七、亲和色谱(Affinity chromatograph),原理:利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力,进行选择性分离。
6、 先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等),再连接上配 基(酶、抗原等),这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。,第三节 固定相与流动相,一、液相色谱固定相(stationary phases of LC),1. 液-液分配及离子对分离固定相 (1)全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体;早期采用 100m的大颗粒,表面涂渍固定液,性能不佳已不多 见;现采用10m以下的小颗粒,化学键合制备柱填料;,(2)表面多孔型担体 (薄壳型微珠担体)3040m的玻璃微球,表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶
7、。 表面积小,柱容量底;,(3)化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相; a. 硅氧碳键型: SiOC b. 硅氧硅碳键型:SiOSi C 稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广; c. 硅碳键型: SiC d. 硅氮键型: SiN,化学键合固定相的特点,1)传质快,表面无深凹陷,比一般液体固定相传质快; 2)寿命长,化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击; 3)耐水、耐光、耐有机溶剂,稳定; 4)选择性好,可键合不同官能团,提高选择性; 5)有利于梯度洗脱;,存在着双重分离机制: (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率:分配为主; 低覆盖率:吸附为主;,2、液-固
8、吸附分离固定相,种类:硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等; 结构类型:全多孔型和薄壳型; 粒度:510 m。,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别: (1)薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体,表面 涂约1%的离子交换树脂; (2)离子交换键合固定相 薄壳键合型;微粒硅胶键 合型(键合离子交换基团) 树脂类别: (1) 阳离子交换树脂(强酸 性、弱酸性) (2) 阴离子交换树脂(强碱 性、弱碱性),4. 空间排阻分离固定相,(1)软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构; 水为流动相。适用于常压排阻分离。 (2)半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物,有机凝胶; 非极性有机溶剂为流动相,不
9、能用丙酮、乙醇等极性溶剂 (3)硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等; 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大,流动相性质影响小, 可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球,具有恒定孔径和窄粒度分布。,二、液相色谱的流动相(mobile phases of LC),1.、流动相特性 (1)液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。流动 相组成改变,极性改变,可显著改变组分分离状况; (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相的极 性小于固定相的极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正 相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性,则称为反相液 液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺
10、序相反。,2.、流动相类别,按流动相组成分:单组分和多组分; 按极性分:极性、弱极性、非极性; 按使用方式分:固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。,3、 流动相选择,在选择溶剂时,溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时:首先选择中等极性溶剂,若 组分的保留时间太短,降低溶剂极性,反之增加。 也可在低极性溶剂中,逐渐增加其中的极性溶剂,使保 留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序: 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六
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