RNA的生物合成.ppt
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1、第七章 RNA的生物合成,一、转录概述 二、转录反应的模板 三、 DNA指导的RNA聚合酶 四、启动子与终止子 五、RNA的酶促合成 六、原核生物RNA的转录后加工 七、真核生物RNA的合成 八、真核生物RNA的转录加工 九、RNA 的生物学功能,第七章 RNA的生物合成 一、转录概述(RNA生物合成概念),RNA几乎总是线性单链的,极少有环状RNA分子。但几乎每个RNA分子都有许多短的双螺旋部分,称为发夹。 除了标准的GC和AU对之外,还有较弱的GU对可帮助单链RNA形成二级结构。 一条正在延伸的RNA链的二级结构会影响这个RNA分子的剩下部分的合成。 一个细胞中含有许多不同的RNA分子,其
2、长度为50个核苷酸到数万个核苷酸不等。,RNA合成需要RNA聚合酶。E.coli细胞中约有RNA聚合酶分子3000个。此酶催化RNA主链中核苷酸间的3,5磷酸二酯键的形成,催化反应速度很快,在37时RNA链的延伸可达5090个核苷酸/秒。 RNA的合成是以DNA为模板合成核糖核苷酸链的过程,故称为转录(transcription)。 RNA的合成非常精确,转录没有校正机制(proofreading)。由于细胞RNA不能自我复制,故即使偶有差错亦不会遗传下去。,双链DNA分子中只有一条链作为RNA模板。作模板的DNA链称为反义链,不作模板的DNA链称为有义链。 如果DNA的两条链均作为RNA模板
3、,则每个基因必将产生两条互补的RNA。而遗传学证明每个基因只合成了一条RNA链。即使合成两条RNA链,其中也只有一条有功能。事实上,在活体内只存在这两条RNA链中的一条。 如将双链DNA加热使之变性,再加入以此DNA为模板所合成的单链RNA,进行退火。结果除复性的DNA双螺旋外,还形成了DNA-RNA杂种分子。结果表明只有一条DNA链被转录。,用RNA聚合酶在体外对DNA双螺旋进行转录,结果取决于DNA模板受到损伤的程度。 例如将T7 DNA变性,RNA聚合酶能与单链DNA结合,两条均能被转录。但如果用天然的完整双链DNA为模板,则RNA聚合酶仅能和称为启动子的顺序结合,从而只能转录在活体内被
4、转录的那条链。 RNA转录还需要两个基本结构元件启动子和终止子。 DNA链上从启动子到终止子为止的长度称为一个转录单位。一个转录单位可以包括一个基因,也可以包括几个基因。,二、转录反应的模板,转录反应不但需要DNA作为模板,而且不同的RNA聚合酶对DNA两股链以及不同的DNA段落都有一定的选择性。,对于不同的基因来说,其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为模板链,或负链(-链);对应的链称为编码链,即正链(+链)。,模板链(-链),编码链(+链),5,5,3,3,5,5,(一)、模板的必要性,实验证明:在RNA聚合酶参与RNA合成的系统中,若是缺少DNA模板
5、,或者事先用脱氧核糖核酸酶(DNase)处理,破坏DNA模板,这个系统就不能合成RNA。若在这个系统中补加DNA,或者使DNase钝化,或分离除去DNase,这个系统就能恢复合成RNA的正常功能。新合成的RNA碱基顺序完全与该系统中DNA的,碱基顺序互补。新生RNA即是模板DNA的互补体。这说明,在RNA聚合酶参与的反应中,DNA不但能起动RNA的合成,而且它也能决定RNA产物的全部碱基顺序。另一方面,在DNA链上有许多可以构成回文结构的对称顺序。它是转录调控因子的识别信号。这都说明模板在转录作用中所处的重要地位。,(二)、RNA聚合酶对 模板的选择,RNA聚合酶对模板的选择包含两层意思。其一
6、是不同的RNA聚合酶转录不同的基因,合成不同的RNA。 其二是RNA聚合酶对DNA的两股链有选择性。 转录(transcription)的不对称性就是指转录只以双链DNA中的一条链作为模板进行转录,将遗传信息由DNA传递给RNA的现象。,(三)、模板中信息连续性,在模板中,基因信息通常是不连续的。在信息内部或者在信息之间,往往存在一些不表达的插入顺序及间隔顺序。这些插入顺序和间隔顺序一般可能与信息顺序一起转录。,初生RNA中的插入顺序或间隔顺序,有的在RNA转录后的“加工”过程中被删除;有一些间隔顺序被保留在mRNA中,作为多顺反子mRNA合成蛋白质时的“标点符号”,或在蛋白质合成中起调控作用
7、(例如,原核生物mRNA中不同顺反子之间的间隔顺序)。,大肠杆菌的RNA聚合酶,具有很复杂的结构。其活性形式(全酶)为15S,由5种不同的多肽链构成,按分子量大小排列分别为(160000),(155000),(3200092000), (40000)和(9000)。每分子RNA聚合酶除有两个亚基外,其余亚基均只有一个,故全酶为:,三、DNA指导的RNA聚合酶,(一)、大肠杆菌RNA聚合酶的结构, 2(465000) (见下表)。 全酶形状为椭圆球形,可结合约60个核苷酸。,*基因图是指传统的E.coli的遗传图谱,E.coli RNA聚合酶的亚基和转录因子,亚基:识别启动子,起始转录。亚基和其
8、他肽链的结合不很牢固,易脱离全酶。,图7-1 大肠杆菌RNA聚合酶与DNA的相互作用,核心酶:全酶脱离亚基剩下的2称为核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。 亚基:是酶和底物结合的部位和催化位点。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通过结合亚基,对全酶有强烈的抑制作用,抑制RNA合成的起始,但不抑制其延长。亚基基因rpoB突变可使细菌对利福平有抗性。,链霉溶菌素(streptolydigin)能抑制RNA链的延长,rpoB突变却可使细胞对链霉溶菌素亦发生抗性。 亚基:其作用是与模板DNA相结合。亚基的碱性较强,适于与模板DNA相结合。肝素是一种多价阴离子
9、,能和亚基结合,从而抑制DNA与RNA聚合酶相结合,进一步抑制转录作用。,亚基:功能现尚未知。然而,当噬菌体T4感染E.coli时,其亚基即在精氨酸上被ADP-核糖化。这种修饰作用使该RNA聚合酶全酶对其原先识别的启动子的亲和力减弱。所以有人认为,亚基的功能可能参与全酶和启动子的牢固结合。 某些噬菌体的RNA聚合酶仅由一条多肽链组成。例如噬菌体T3和T7的RNA聚合酶分子都是一条多肽链,分子量约11000,它们能很快合成RNA,其速率在37时可达约200核苷酸/秒。,噬菌体RNA聚合酶只能识别噬菌体本身所有的启动子,不能识别其他启动子。宿主细胞的RNA聚合酶却能转录细胞内的许多转录单位(100
10、0个)中的任意一个。这些转录单位中有一些可由RNA聚合酶直接转录,不需要其他因子的帮助。但大多数转录单位仅在更多的蛋白质因子存在下才能被该RNA聚合酶所转录。,(二)、RNA聚合酶的基因,E.coli RNA聚合酶各亚基的基因(除亚基基因尚不详外)均存在于三个操纵子中,这些操纵子还含有蛋白质合成和DNA合成所需的基因。,操纵子含有DNA引物酶的基因,有两个连续的启动子,同rRNA的操纵子一样,受ppGpp分子的调控,故与生长速度有关。 操纵子前面两个基因L11和L1,有时被认为组成另一个独立的操纵子,因为在L10基因之前另有一启动子。这些基因编码核糖体蛋白。 操纵子中基因前面有S13、S11、
11、S4 三个基因,后面有L17基因。,和操纵子中基因的转录量并不相等,在和操纵子的核糖体蛋白基因的后面有衰减子(attenuators),可使其后的RNA聚合酶基因的转录大为降低。因此,在每个细胞中RNA聚合酶亚基的数目(约3000个)要大大少于核糖体蛋白的分子数(约20000个),这是符合细菌需要的。,然而令人不解的是DNA引物酶基因位于基因之前,而细胞内亚基的数目反而要比引物酶分子数多60倍(3000比50)。这些操纵子内都有几个次要的启动子,说明实际的调控作用还要更为复杂得多。现在还不清楚这些操纵子是如何进行调节的。,L17,S4,S13,S11,p, 操纵子,DNA引物酶,主要启动子(P
12、):在操纵子的左侧,向右转录。 次要启动子(p):包括操纵子中的PHS (热休克下才有活性的启动子), 位于操纵子之内,仅启动在其右侧的基因。,RNA聚合酶的作用,识别启动子。主要依赖于亚基, 亚基只参与转录的起始,并决定转录的方向。 与DNA结合并使之解链,另外还具有解旋、重新使DNA螺旋化作用。 催化RNA聚合反应。负责三种RNA合成。 RNA聚合酶核心酶通过与不同的亚基结合,识别不同的启动子。,(三)、真核生物RNA聚合酶,细菌只有一种RNA聚合酶,它完成细胞中所有RNA的合成。真核细胞的转录机构更加复杂。真核细胞核内产生三种RNA聚合酶,位于不同的部位,且均有复杂的亚基结构。每种酶负责
13、不同种类基因的转录。它们的一般性质见下表。,真核细胞的三种RNA聚合酶,RNA聚合酶的活性最显著。位于核仁中,负责转录rRNA基因(rDNA),细胞内的RNA绝大部分是rRNA。其活性不被-鹅膏蕈碱所抑制。 RNA聚合酶位于核浆中,负责hnRNA的合成。hnRNA是mRNA的前体。其活性可被低浓度的-鹅膏蕈碱所迅速抑制。,RNA聚合酶负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。聚合酶对-鹅膏蕈碱的反应则不尽相同:在动物细胞中聚合酶可被高浓度-鹅膏蕈碱所抑制,而在酵母和昆虫细胞中则不会被抑制。,某些常用的转录抑制剂,粗制的真核生物RNA聚合酶大而复杂,相对分子质量达500000或更多。其亚基组成亦很
14、复杂:每个酶分子有两个大亚基,(一个约200000,另一约140000),还有10个以下的小亚基,每个相对分子质量约为10000-90000。,三种酶中也有一些共同的亚基,在复杂的真核细胞中执行不同功能的三种酶可能是由一个原始的酶进化而来。因为直到现在还不能用亚基来重建活性的酶分子。因此,还难以提出确切的证据说明这些亚基是否真正都是酶分子的固有的组成部分,也不知道哪些亚基负责催化,哪些负责调节功能。,线粒体和叶绿体中的RNA聚合酶要小得多,并且和细胞核中的酶完全不同。当然,细胞器的基因组小得很,故其聚合酶所需要转录的基因数也很少。而且转录的调控看来也要简单得多。所以这些酶类似于噬菌体RNA聚合
15、酶。,所有三种RNA聚合酶均有其对应的启动子和终止子。以聚合酶所识别的启动子研究得最多,并发现这种启动子很奇怪不是位于转录起始点的前面,而是在转录起始点的下游。 RNA聚合酶合成mRNA,它是最直接和遗传调节相关的酶。因此对聚合酶的研究是目前的热点之一。,困难之处在于:除非有一些现在还不能确定的一些蛋白质存在,完全纯化的酶似乎不能在天然启动子上工作。这些不确定的蛋白质可能包括一些起始因子(类似细菌中的因子),但是肯定还有其他几种因子。用突变分析方法证明,影响转录作用的DNA节段远比细菌启动子要长得多。在细胞内增强子对启动子的活性很重要;对增强子的研究也是目前的热点之一。,1. 原核生物启动子
16、启动子是指RNA聚合酶识别、特异结合和开始转录的一段DNA序列。 RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子(蛋白质)称为转录因子。 在基因表达调控中,转录起始是关键,基因是否能表达决定于在特定的启动子起始过程。,三、启动子与终止子 (一)、启动子和转录因子,只有RNA聚合酶能够特异性地与启动子相结合。亚基起识别作用,没有时,核心酶偶而亦能起始RNA的合成,但有许多起始错误,而且核心酶所合成的RNA链的起始在某个基因的两条链上是随机的。但当存在时,则起始在正确的位点上。,RNA聚合酶能否与启动子相互作用是起始转录的关键问题。 不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同。可能对调控转录起始的频率,即对基因表
17、达的程度有重要作用。,为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢? RNA聚合酶分子上可能有一个活性中心能够识别出DNA双螺旋上某特异序列的化学结构; 启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合,就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。,1) 启动子的共同顺序,利用“足迹法”和测序技术,对100多种启动子的顺序进行了比较,发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序,称为-10和-35序列。这两个序列的特征如下: -35区:T85T83G81A61C69A52 (-35bp,-35序列) -10区:T89A89T50A65A65T100 (-10bp,-10
18、序列),启动子的共同顺序,大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence),只有少数几个核苷酸的差别。共同顺序是启动子的关键部位。,40 Sextama 20 Pribnow 1 1.lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG 2.fdG2 CTTTTTGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAA 3.PL GGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCAG 4.PR GTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAA
19、TGGTTGCATGTA 5.tRNAlTyr CGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTT T82T87G78A65C54A45T80A95T45A50A50T98 17bp 图7-5 几种原核启动子的结构顺序比较,启动子的共同顺序,-35序列是RNA聚合酶全酶的识别位点,对全酶有很高的亲和性。 如果-35序列发生突变或缺失,将大大降低对全酶的亲和性,即降低RNA聚合酶与启动子的结合速度,但不影响转录起始位点附近DNA 双链的解开。,-10序列又称为Pribnow盒,或TATA盒,是 RNA聚合酶全酶的紧密结合位点。 -10序列的突变不影响R
20、NA聚合酶与启动子结合的速度,但会降低双链解开的速度。 TATA盒决定着转录的方向。,可见,-35序列提供RNA聚合酶识别的信号,-10序列则有助于DNA局部双链的解开,两者共同决定了启动子的强度,也调控了转录的速度和RNA分子数。因此,-10和-35序列都很重要。同时有研究表明:离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱;破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基,其余25%亦为离共同顺序较近顺序中的碱基的改变。,在某些操纵子的启动子的上游,还存在有CAP-cAMP复合物的结合位点。 CAP-cAMP复合物与启动子的结合是基因调控作用的一部分。,原核生物启动子的序列长约20200bp
21、不等。E.coli典型的启动子结构(80bp)如下:,原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列(-35和-10)之一。在这种情况下,RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子,而需要有辅助蛋白质的帮助。,结合位点,TGTTGACA,TATAAT,起始位点,1018bp,58bp,-35序列,-10序列,CAP-cAMP,启动子附近的DNA顺序也能影响启动子的功能。 rRNA合成的起始位点上游50到150bp之间的顺序是启动子的完全活性所必需的。如果这段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代,则转录起始的频率将降低10倍。 远离部位的富有AT的DNA顺序能增进转录起始的频率。,上游顺序是某些RNA聚合酶
22、的“激活蛋白”的结合部位。也是拓扑异构酶的结合部位,这有利于转录起始的超螺旋状态的产生。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离,影响到-10和-35区的DNA结构细节。,E.coli RNA聚合酶与启动子结合的过程可分为两步。酶识别启动子,并与其结合形成“关闭”复合体(即双螺旋形式)。这一步所识别的是-35序列。“关闭”复合体转变为“开放”复合体(即双螺旋解旋,两条链分开),此时酶的结合比较紧密。,2) RNA聚合酶与启动子的结合,在这个转变中,富含AT碱基对的-10区约有17bp被解旋,暴露出模板链。-10区的突变可阻碍“开放“复合体的形成。许多突变改变了-1
23、0序列中的碱基,但并未减低其AT对的水平,却仍然能阻碍其“融化“为开放复合体,可见-10区除了要易于融化之外,还必须有特异的形状,以便RNA聚合酶能够识别它。,RNA聚合酶与启动子的结合模式图,真核生物三种RNA聚合酶都有各自的启动子。目前对真核生物启动子了解较少,原因: 原核生物启动子的鉴定方法不能直接运用于真核生物; 没有找到高等真核生物启动子的突变体; 由于转录因子多,其结合位点多,不易找到各种RNA聚合酶的结合位点; RNA聚合酶不易纯化,缺乏酶的结构和活性功能的资料,使酶与启动子的结合和检测有较大困难。,2. 真核生物启动子,又称rRNA基因启动子或型启动子。不同真核生物型启动子序列
24、有较大的差异,缺乏保守性。目前发现有两个区域是转录必需的: -40+5近启动子部分:为核心序列,其功能是决定转录起始的精确位置。这一段序列的全部或部分缺失,被同样长度的,1) RNA聚合酶启动子,寡聚核苷酸替代,在选择性位点作单个碱基突变等变化,都会消除或强烈降低 rDNA转录能力。 -165-40远启动子部分:又称上游控制元件(UCE),其功能是影响转录的频率。这段序列受到缺失、置换、插入等破坏,可造成转录下降100倍。,又称蛋白质基因启动子或型启动子。该启动子有四个区域对转录起始和活性起着调控作用,是真核基因转录不可缺少的。 转录起始位点:其碱基大多为A,两侧各有若干个嘧啶核苷酸(Inr序
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