糖酶知识.ppt
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1、糖 酶 (Carbohydrases),应用 淀粉食品加工 糖工业 发酵工业 果蔬加工,糖酶的作用,(1)水解:大分子多糖小分子寡糖或单糖; (2) 转糖苷作用:催化糖单位结构上的重排 产生新糖类化合物 (3)作用于酯化的糖类,常见糖酶的种类,淀粉酶 乳糖酶 纤维素酶 果胶酶,淀粉酶,催化淀粉、糖原和糊精中糖苷键水解的一类酶,属水解酶类。 包括: -淀 粉酶 、 -淀粉酶、脱支酶、异构酶、葡萄糖淀粉酶、环状糊精葡萄糖基转移酶,由D-葡萄糖以-1,4和-1,6糖苷键连接的高分子物质。,淀粉,不同淀粉酶的水解方式,最终产物是 。,小糊精,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 脱支酶,选择填空:小糊精 -
2、葡萄糖和极限糊精 直链淀粉 葡萄糖,最终产物是 。,-葡萄糖和极限糊精,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 脱支酶,选择填空:小糊精 -葡萄糖和极限糊精 直链淀粉 葡萄糖,最终产物是 。,葡萄糖,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 脱支酶,选择填空:小糊精 -葡萄糖和极限糊精 直链淀粉 葡萄糖,最终产物是 。,直链淀粉,-淀粉酶 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 脱支酶,选择填空:小糊精 -葡萄糖和极限糊精 直链淀粉 葡萄糖,-淀粉酶的性质 ( -Amylase),命名:-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶 EC3.2.1.1,也称为液化酶。 分布: 植物:如玉米、稻米、高粱、谷子 哺乳类动物:如人及动物唾液、胰液
3、微生物:枯草杆菌、芽孢杆菌、吸水链霉菌、米曲霉、黑曲霉等,性质,分子量:约5万 金属酶:属于金属酶,每个酶分子中含有一个Ca2+,其与酶分子结合非常牢固。 激活剂和稳定剂,(3) pH对-淀粉酶的影响,一般在pH5.58时稳定,pH4以下容易失活,酶的最适pH值为pH56。 不同来源的-淀粉酶具有不同的pH特性 酶的最适pH 与 pH稳定性 -淀粉酶最适pH值: 黑曲酶为4.0;高梁芽4.8,小麦4.5左右 从人的唾液和猪的胰脏的较窄6.07.0 枯草杆菌得到的具有较宽广pH5.07.0 嗜热脂肪芽孢杆菌的狭窄3.0左右 大麦芽4.85.4,(4)温度对-淀粉酶活力的影响,-淀粉酶在40时活力
4、最高,50以上容易失活,一些细菌来源-淀粉酶的最适温度为70。 不同来源的-淀粉酶具有不同的热稳定性和最适温度。 如果以每分钟升高1.5的速度加热-淀粉酶粗制剂的溶液,那么在温度达到80时,几种-淀粉酶的百分残余活力如下: 霉菌1,谷类25,而细菌92。,耐热-淀粉酶,地衣形芽孢杆菌-淀粉酶的最适温度为 ,而淀粉液化芽袍杆菌-淀粉酶的最适温度为 。,92,70,温度对酶的半衰期的影响,温度对-淀粉酶半衰期的影响 底物:31.5玉米淀粉,pH6.5,钙离子 浓度,2.1.3.2 -淀粉酶的性质 ( -1,4-葡聚糖麦芽糖水解酶 EC 3.2.1.2 -Amylase),来源: 高等植物:如小麦大
5、麦芽、甘薯和大豆。 微生物:如多黏芽孢杆菌等 。 哺乳动物无 通常是从大豆提取蛋白质后由废水中提取或从蒜苗制取淀粉的废水中得到的。麸皮、大麦、麦芽也是生产-淀粉酶的原料。微生物也是重要的原料。,-淀粉酶性质,(1)pH 对-淀粉酶活力影响 植物:最适pH5.06.0 范围5.08.0 微生物:最适pH6.07.0 范围4.09.0,(2)温度对-淀粉酶活力的影响,最适温度4060 不同来源的酶不同,微生物来源的耐热性优于植物来源的。 大豆的在最适pH5.5时。65水解30min损失50,70水解30min可使酶完全失活。 同样条件下,山芋粗酶在6065时不失活。 大麦中的-淀粉酶的热稳定性低于
6、- 淀粉酶。,一、酶活力 二、酶活力单位 1.国际酶活性单位 在最适条件下(温度可采用25或其它选用的温度,pH等条件均采用最适条件),每1 min 催化1 mol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位(IU)。,2.实用单位 在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活单位 -淀粉酶活力单位定义为:在60pH6.2条件下,每小时可催化1g淀粉所需要的酶量为一个单位(U). 直接以光密度值表示:单位时间增加或减少0.001个光密度值为一个酶活单位(U) ;例如溶菌酶、过氧化物酶 DNA聚合酶以在特定反应条件下,30分钟内催化10nmol dNTP合成为三氯乙酸不溶物所需的酶量(U) ; T4
7、DNA连接酶活力单位定义为:在20l反应体积中,16,30分钟内,将50%的Hind酶切的DNA片段重新连接起来所需的酶量(U) 。,三、酶活力测定方法 终止反应法(Stopped method) 连续反应法(Continuous method),终止反应法 将酶反应按时即刻完全停止,再确定产物的生成量或反应物的消耗量,算出酶活性。 可以采用用酶法检测、化学检测、放射化学检测、光学检测、气体检测等生化检测技术。 比色(光吸收)、滴定、气体体积度量等,常用的终止酶反应的方法: 反应时间一到,立即取出适当反应液,置于沸水浴中,加热使酶失活; 加入适宜的酶变性剂,如三氯醋酸(TCA)等,使酶变性失活
8、; 加入酸或碱溶液,使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH值而使反应终止; 将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中,使反应液的温度迅速降低至10以下而终止反应。,连续测定法 基于反应过程中用仪器连续测定产物的生成量或底物的减少量(动力学法),算出酶活力。 光谱吸收、电位、酸碱度、黏度、气体体积、热量的变更等 直接测定法 间接测定法 酶偶联测定法,酶法检测 用其它纯酶将产物直接或间接转变成为分光光谱仪或荧光光谱仪测出的化合物。 偶 联 法(coupled method); 指示酶(Indicator enzyme),e.g. 葡萄糖氧化酶活力 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 葡萄糖内脂+H
9、2O2 过氧化物酶(纯品)和木酚 过氧化物酶 H2O2 + 木酚 4-甲氧联酚 测A436nm 4-甲氧联酚的量 H2O2 的生成量 酶活力(葡萄糖氧化酶活力 ),四、酶活力测定的条件与注意的问题 1.反应时间 应选择在酶反应的初速度范围内 通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的近似值 2. 酶量 必须和测得的活性有线性关系 3.底物 酶催化的专一性选择合适的底物和底物浓度。底物浓度应该大于5Km;一定浓度的底物溶液;均匀一致;达到酶反应所要求纯度使用的底物溶液;一般要求新鲜配制;预先配制后置于冰箱中保存备用;,4.反应条件 确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度和激活剂浓度
10、等反应条件 温度 尽量保持恒定不变:反应应该在恒温水浴槽中进行 pH值 必须采用一定浓度和一定pH值的缓冲溶液 有些要求添加一定浓度的激活剂 e.g.淀粉酶需要钙离子;,注意问题 1. 一定条件 2. 混合均匀 3. 准确计时 4. 设置对照,实验剖析 淀粉酶活性的测定 -淀粉酶 80保温20min 不耐酸在 pH值3.6钝化 -淀粉酶 不耐热,在高温下易钝化 将提取液加热到70保温15min以钝化-淀粉酶,便可测定-淀粉酶的活性;或者将提取液用pH 3.6的醋酸溶液在0下加以处理,钝化-淀粉酶,以求出-淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖,可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能
11、将黄色的3,5-二硝基水杨酸还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的浓度成正比,以标准麦芽糖做标准曲线,可求出麦芽糖的含量。 以每克样品在单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。,-淀粉酶活性的测定 (1)取4支试管编号,注明其中两支为对照管,两支为测定管。 (2)于每管中各加酶液1mL,在700.5恒温水浴中加热15min,-淀粉酶因受热而钝化,取出后迅速冷却。 (3)向对照管中加入4mL 0.4 mol/LNaOH,以使酶失活。 (4)在4支试管中各加入lmL pH 5.6柠檬酸缓冲液。 (5)将4支试管另置于400.5恒温水浴中保温15min,
12、再向各管分别加入40下预热的1淀粉溶液2mL,摇匀后立即放入40水浴中准确保温5 min后取出,向各测定管迅速加入4mL 0.4mol/LNaOH溶液,终止酶活性。,+-淀粉酶活性的测定 取4支试管编号,其中2支为对照,2支为测定管,各加入稀释酶液1mL及1mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。以下重复-淀粉酶测定的第(3)(5)的操作。 -淀粉酶活性的测定,-淀粉酶活性麦芽糖(mg)鲜重(g) 5min= (A)样品稀释总体积 样品鲜重(g)V (+)-淀粉酶总活性麦芽糖(mg)鲜重(g) 5min= (B)样品稀释总体积 样品鲜重(g)V 酶活单位的定义 (以每克样品在单位时间内生成麦芽糖的毫克数
13、表示淀粉酶活性的大小。) U,延伸 如何测定酶活力? 测定酶活力应注意什么问题? 测定酶活力在实际中的应用,淀粉酶在淀粉糖生产中的应用,产品种类,葡萄糖 麦芽糖 果糖 低聚糖 高果糖浆 医药、食品、发酵行业自用糖(抗生素、味精、氨基酸等原料用糖),-淀粉酶在淀粉糖生产上的应用,酶法生产葡萄糖的优点 糖化液没有苦味、葡萄糖纯度高、提高淀粉投料浓度、葡萄糖收率高,双酶法的基本工艺,淀粉,调浆,液化,糖化,脱色,过滤,离子交换,真空浓缩,结晶,分离,真空干燥,葡萄糖产品,液化机理, 糊化, 液化,(1) 液化,液 化 方 法, 升温液化: 原料淀粉浓度:30%40% pH值:6.06.5 加入:-淀
14、粉酶、CaCl2 、 NaCl 升温到:8590 保温:45min,采用喷射器,蒸汽和调配好的淀粉浆从不同的入口进入,利用蒸汽把形成薄层的淀粉乳瞬间上升到指定的温度,使之糊化、液化。喷射后再进入保温维持罐内维持一定时间 喷射嘴温度:105110 , 保温维持缸温:9597 , 维持时间:1h左右。, 喷射液化,地衣芽孢菌产酶能在110 以上利用!,糖化机理,淀粉产物,糖化酶水解,葡萄糖,方法,糊精,糖化酶,60 保温4048h,糖化液DE97%左右,升温80 以上,灭酶。,(2)糖化,冷却5560 ,调pH4.55.0,酶法制糖 酶法制味精 酶法生产啤酒、酒精、白酒、黄酒 酶法生产柠檬酸、抗生
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