生物:5.3《血红蛋白的提取和分离》教案(2)(新人教版选修1).pdf
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1、1 / 7 课题 3 血红蛋白的提取和分离 一、学习目标: 本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离,使学生能够体验从复杂体系中提取生物 大分子的基本过程和方法,并了解色谱法,电泳法等分离生物大分子的基本原理,为今后 学习运用这些技术打下基础。b5E2RGbCAP 二、重点: 凝胶色谱法的原理和方法 三、难点: 样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 【基础梳理】 一、凝胶色谱法 1、概念:也称做;是根据分离蛋白质的有效方法。 2、原理 红细胞的洗涤:目的是。分离时采取,直至上清液中没有,表明红细胞已洗涤干净。 (2血红蛋 白的释放:在和的作用下,红细胞破裂,释放出血红蛋白。 (3分离血
2、红蛋白溶液:把离心后,将试管中的液体用过滤、除去 ,于中静置片刻后,分离出下层的。 2、粗分离:即透析 (1方法:将血红蛋白溶液装入,将放入一定量适宜浓度的中,透析。 (2目的:将的杂质除去。 (3原理:透析袋能使小分子自由进出,而将大分子物质保留在袋内。 3、纯化 :通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下: (1凝胶色谱柱的制作。 (2凝胶色谱柱的装填 材料:本实验使用的是。 方法:凝胶用充分溶胀后。配成,一次性倒人色谱柱内。不能有存在;不能发生流干露 出凝胶颗粒的现象。 (3样品的加入和洗脱 a、准备:加样前,打开流出口,使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐,关闭出口。 b、
3、加样:用小心地将1mL 透析后的样品加到的顶端,注意不要破坏。 c、加样后:打开下端出口,使样品渗入内。 洗脱:加入,打开下端出口,进行。 4、纯度鉴定:在鉴定的方法中,使用最多的是。五、操作提示 1、红细胞的洗涤:、与十分重要。过少,无法除去血浆蛋白;过高和过长会使等一同沉 淀,达不到分离效果。 2、色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在中膨胀,可以将加入其中的 用加热,加速膨胀。 3、凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的,降低。 4、蛋白质的分离:如果红色区带地移动,说明色谱柱制作成功。 【探究归纳】 一、人们用鸡的红细胞提取DNA,而用人成熟
4、的红细胞提取血红蛋白的原因是什么? 3 / 7 二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水? 三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么? 四、凝胶色谱法的原理归纳 【典例导析】 类型一凝胶色谱法分离蛋白质 【例 l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术,由于设备简单、操作方便,不 需要有机溶剂,对高分子物质有很高的分离效果,目前已经被生物化学、分子生物学、生 物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用,不但应用于科学实验研 究,而且,已经大规模地用于工业生产。据图回答问题:DXDiTa9E3d ,洗脱时,对洗 脱液的流速要求是。RTCrpUDGiT 【思路点拨】用凝胶
5、色谱技术分离各种大分子物质时,大分子物质先洗脱出来,然后是小 分子物质。大分子物质由于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布于颗粒之 间,所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入 凝胶颗粒的微孔,即进入凝胶相内,在向下移动的过程中,从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒 间隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入和扩散,小分子物质的下移速度落后于大分 子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密,以降低 凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时,不得有气泡存在,因为气泡会搅乱洗脱液中 蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中,不能
6、发生洗脱液流干,露 出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况,凝胶色谱柱需要重新装填。5PCzVD7HxA 互动探究 (1凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗? (2题目中 a和 b 的分离度与凝胶色谱柱的高度有关吗? (3除了题目中提到的气泡需要重装以外,还有哪种情况需要重装? 类型二探讨电泳的原理 4 / 7 【例 2】蛋白质分子中,氨基酸的 -氨基和 -羧基虽然大部分结合成为肽键,但是蛋白质 分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团,如肽链末端的-氨基和 -羧基、天冬氨酸和谷 氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团,所以蛋白质是两性电解质。 在酸性溶液中,碱性基团的解离增大,使蛋
7、白质带正电荷;在碱性溶液中酸性基团的解离 加强,使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH 时,蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解 离相等而呈等电状态,这时的溶液pH 叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质 分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题:jLBHrnAILg (1多数蛋白质的等电点近于5,一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点(“偏高”还是 “偏低” 。 (2根据等电点的不同,你能用方法将不同种类的蛋白质分子分开。 (3简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。 【思路点拨】本题深入到蛋白质内部,从蛋白质分子带电性质及数量的角度,引导学生理 解电泳法分离蛋白质的原理。含碱性基团较
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