三维重组人工皮肤模型在化妆品安全性评价中的应用分析.pdf
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1、1 _ 基金项目:国家自然科学基金项目(51403006)资助 。 三维重组人工皮肤模型在化妆品安全性评 价中的应用 孔雪聂鹏举何文丹唐颖 * (中国化妆品创新协同中心/北京市植物资源研究开发重点实验室/北京工商大学理学院化妆品系,北京 100048) 摘要 : 化妆品安全性评价是对化妆品进行从原料选用到准投放市场产品的潜在不良反应进 行定性和定量的毒理学评价。传统的化妆品安全性评价主要采用动物试验,随着科学技术的 发展和3R(减少、替代和优化)原则的推动,三维重组人工皮肤模型因具有与人类皮肤相 似的生理结构和代谢功能而在的毒理学研究中获得了广泛的发展。本文主要综述了三维重组 人工皮肤模型在化
2、妆品皮肤刺激/腐蚀性评价、眼刺激性评价、光毒性评价和遗传毒性评价 方面的应用现状, 分析了皮肤模型的优缺点,并对其在化妆品安全性评价中的应用前景以及 发展策略提出了意见和建议。 关键词: 三维重组人工皮肤模型;化妆品安全;体外毒理学;动物替代方法 Safety Evaluation of Cosmetics based on In Vitro three-dimensional reconstructed human epidermis(3D-RHE )models KONG Xue, NIE Peng-Ju, HE Wen-Dan, TANG Ying (China Cosmetic Col
3、laborative Innovation Center/Beijing Key Lab of Plant Resource Research and Development/Department of cosmetics, School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048,China Abstract: Cosmetics safety evaluation is employing a series of toxicological tests, on both qualitative
4、 and quantative levels, to assess the potential risks for the daily use of selected cosmetic ingredients and final products. Traditional safety evaluation is mainly using animal tests. With the development of in vitro science and 3Rs (Reduction, Replacement and Refinement) principle, three-dimension
5、al reconstructed human epidermis models have been developed and applied in cosmetic safety evaluation. Reconstructed human skin models possess anatomy and metabolism biology similar to real human. This paper reviews the current status of three-dimensional reconstructed human epidermis models applied
6、 in skin irritation/corrosion, eye irritation, photo-toxicity and genotoxicity assessment of cosmetics. The advantages and disadvantages of using skin models are also discussed with comments and suggestions for its future development. Keywords: three-dimensional reconstructed human epidermis models;
7、 cosmetic safety; in vitro toxicity; animal alternative methods 2 近年来化妆品行业问题频发,化妆品的安全性日益受到企业和消费者的关注。化妆品 的安全性评价是对化妆品潜在不良作用进行定性和定量的认定和评价,目的在于降低化妆品 不良作用、 预测化妆品的远期效应以及制订安全接触限值 1 。传统的安全性评价主要采用动 物模型进行。然而,动物试验存在评价周期较长、重复性差、精确度低等缺点,而且动物与 人具有种间的生理与敏感性差异,因此动物试验结果在外推到人类时具有不确定性。同时, 根据欧盟化妆品规程第7次修正案 (2003/15/EC,2
8、003)规定 2 ,2013年起欧盟已全面禁止动物 实验, 不再允许成员国进口和销售曾进行过动物试验的化妆品原料和成品。因此, 以三维重 组人工皮肤模型等为代表、采用人工培养的组织或细胞等非生命系统的体外试验因具有试验 周期短、实验条件可控和结果易于定量等优点而日益受到企业和科研机构的重视。 1 三维重组人工皮肤模型 三维重组人工皮肤模型(3D-RHE model)是目前在化妆品体外安全性评价中的研究热 点。 皮肤模型是将人的正常皮肤细胞培养于特殊的插入式培养皿上而得到的具有高度模拟人 体皮肤、具有完整三维解剖结构的皮肤组织模型 3 。皮肤模型的表面具有由人表皮角质细胞 分化形成的角质层,与单
9、层细胞培养物相比,对化妆品受试物的溶解性限制少。未经稀释、 极端 pH和“ 不可溶的 ” 测试材料均可直接用于皮肤模型,同时能够根据人体所接触光的强度、 时间以及波长范围进行光接触试验。此外, 由于大部分皮肤模型由人的初代细胞组成,因此 可以避免因种间差异而带来的试验结果偏差 4 。 现已验证的皮肤模型在基因表达、组织结构, 细胞因子、 组织活力等方面与人体皮肤都具有高度一致性 5 。皮肤模型的研发之初主要用于 临床上大面积皮肤损伤与缺失的修复。美国于 70年代成功构建了的由上表皮细胞组成的表皮 模型,成为皮肤模型发展的一个里程碑。皮肤模型于 90年代开始应用于化妆品的体外评价 6 。 经过二
10、三十年的发展,各种皮肤模型(见表1)目前广泛应用于化妆品安全性评价中的皮肤 刺激 /腐蚀性 7 、眼刺激性 8 、光毒性 9 、遗传毒性 10和致敏性5 等。不同类型的化妆品安全 性评价,所使用的皮肤模型及其检测指标也有一定差异(表2)。 3 表 1 商品化的三维重组人工皮肤模型 名称制造商国家模型特征 EpiSkin TM 欧莱雅法国 以乳房整形手术去除皮肤组织的表皮角质形成细胞为种子细胞, 采用胶原介质培养而成的表皮重建模型 EpiSkin TM 欧莱雅中国 以中国成年人阴茎包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞,采 用胶原介质培养而成的表皮重建模型 EpiDerm TM MatTek 美国
11、 以包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞,采用无血清培养基 培养而成的表皮重建模型 SkinEthic TM 欧莱雅法国 以包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞,采用惰性聚碳酸酯 酶介质培养而成的表皮重建模型 EpiKutis TM 陕西博溪生物 科技有限公司 中国 以儿童包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞,采用无血清培 养基,液下培养后气液面培养而成的表皮重建模型 EpiOcular TM MatTek 美国 以正常人新生包皮上皮组织的细胞为种子细胞,采用无血清 DMEM 培养基( EGF,胰岛素, HYD 等)的气液面培养方式培养 而成的无角质层的角膜上皮模型 EpiCorneal TM
12、 MatTek 美国 以正常人角膜上皮组织的细胞为种子细胞,采用无血清培养基的 气液面培养方式培养而成的无角质层的角膜上皮模型 HCE SkinEthic 法国 以永生化人角膜上皮组织的细胞为种子细胞,采用气液面培养方 式培养而成的无角质层的角膜上皮模型 FP-3D 北京富龙康泰 生物技术有限 公司 中国全层皮肤模型 Strata Test Stratatech 美国使用人体角质细胞系和NIKS 形成的全层皮肤模型 Phenion FT Henkel 德国 新生儿包皮原代角质细胞培养于胶原支架成纤维细胞,形成结缔 组织作为多层上皮细胞层的基础 Graftskin LSE Organogenes
13、is 美国 以表皮角质细胞为种子细胞,采用气液面培养方式培养于包含胶 原质的成纤维细胞中 LabCyteTM EPI-MODEL Japan Tissue Engineering 日本 来自新生儿包皮的角质细胞和3T3-J2 在惰性过滤器基质中生长, 采用气液面方式培养 表 2 化妆品安全性评价种类及其皮肤模型及检测指标 化妆品安全性评价适用皮肤模型检测指标 皮肤刺激性 EpiDerm? 7,14 , SkinEthic? 14 Episkin?/LabCyte EPI-Model 14 皮肤刺激性检测(SIT)、 ET50 值和细胞因 子(IL-10 、IL- 1 、TNF- ) 11, 1
14、5的释放量 眼刺激性EpiOcular? 8 EpiOcular TM 眼刺激试验 (EIT) 17 光毒性 EpiSkin TM28, EpiKutis?29, EpiDerm? 9, 30, SkinEthic?31 MTT 法检测细胞活率, 细胞因子 (IL- 1 , IL- 1 和 IL-6) 26, 27的释放量 遗传毒性EpiDerm? 35, 36 皮肤模型微核试验和皮肤模型彗星试验 4 本文现就皮肤模型在化妆品皮肤刺激性,眼刺激性,光毒性和遗传毒性中的应用综述如下: 2 皮肤模型在化妆品安全性评价中的应用 皮肤刺激性、 眼刺激性、 光毒性和遗传毒性是化妆品安全性评价中的重要检测
15、项目。在 我国,皮肤和眼睛刺激和光毒性试验主要使用动物模型(如兔、豚鼠) 12 ,但残忍性和缺 乏科学的准确性使其被欧盟和美国禁止使用。以眼刺激为例, 由于兔眼无泪腺,在大多数情 况下实验数据会过度预测人体反应。采用细胞培养和微生物研究遗传毒性具有良好的灵敏 度,但实验的精度较低,对样品的溶解度也有限制。相比之下,皮肤模型模型与人体皮肤具 有很好的相似性,试验精度高、灵敏度高、重现性好,因此被越来越多地应用在以上化妆品 安全性评价。目前多种皮肤模型结合不同毒理学靶位点可被运用于这些领域。(表2)。 2.1 皮肤刺激性 皮肤刺激性是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤 13 。目前皮肤刺激性的
16、体外 评价方法有细胞法、离体皮肤组织法和皮肤模型法。由于皮肤毒性作用的复杂性,采用细胞 法虽然标准化程度高、成本低,但由于单层细胞的结构简单、不具备屏障功能,实验结果有 时会过高预测毒性作用。离体皮肤组织法主要采用尸体或美容外科手术获取的皮肤,皮肤来 源不稳定且价格高昂。从20世纪 90年代开始, 三维重组人工皮肤模型成为评价化妆品皮肤刺 激性的理想模型。现经ECVAM 验证可用于皮肤刺激性评价的皮肤模型有EpiSkin TM 、 EpiDerm TM 和EpiEthic TM 三种。 目前,皮肤模型体外刺激性评价主要包括皮肤刺激性单点试验(Skin Irritation Test , SIT
17、) 14 和时间毒性( Time-to-Toxicity )试验 15。根据 OECD TG 439 指南14,SIT试验以固定时间 将皮肤模型暴露于化妆品原料,以MTT 试验根据皮肤表面组织活力的降低程度( 50%为阈值) 可将受试物区分为刺激性(I)和非刺激性(NI )。而对于部分温和的化妆品,需要延长受试 物在模型表面的停留时间,按照不同时间点进行暴露,以时间毒性(ET50 )进一步区分轻 度至极轻度的刺激性 15。因此时间 -毒性试验特别适用于对化妆品原料或配方与时间相关的 刺激性进行比较:ET50越小,表示模型对化妆品的耐受时间越短,则化妆品的时间毒性越 强。在皮肤刺激性的发生过程中
18、,角质形成细胞细胞会释放出炎性细胞因子(如 IL-1 ,IL-6 , IL-8 , IL- , TNF- ) ,这些细胞因子的释放 (尤其是 IL- 1 ) 可以作为 MTT 试验的重要补充 11,15 。 Kand rov 7 等使用 EpiDerm SIT 验证了皮肤模型在皮肤刺激试验中的可行性,可以区 分刺激性的有无,但试验发现一些受试物可能受MTT 干扰。 Spiekstra 等还试图用皮肤模型 根据 EC50 值来决定化妆品的皮肤刺激效价,而非对刺激性与非刺激性的简单区分 16。 总之, 使用皮肤模型评价化妆品的皮肤刺激性,操作简单快速, 评价指标直观, 不仅可以区分刺激 性的有无,
19、还可以进一步区分刺激性的强弱和时间毒性。 2.2 眼刺激性 眼刺激性是指受试物作用于眼睛后在21 天内产生的可逆性变化 17。目前通过 ECVAM 验证的眼刺激性评价方法主要有(1)离体器官试验:牛角膜浑浊及通透试验(BCOP) 18和隔 离鸡眼试验 (ICE) 19 ,( 2)基于细胞毒性和细胞屏障功能的试验:微生理计(CM) 20 和荧光 素渗漏试验方法(FL) 21 ,(3)EpiOcular TM 眼刺激试验 (EIT) 17 。目前单一试验并不能完全替 代兔眼试验,因此在评价眼刺激时常采用分级策略将结合多种体外试验方法进行评价。 评价眼刺激性时使用的三维重组角膜上皮模型(3D-RhC
20、E) 无角质层, 使其与普通模型相 5 比具有更高的灵敏度 22。根据 OECD TG 492 指南17 ,测试时采用正常人新生包皮上皮细胞 体外重建类人角膜上皮模型EpiOcular TM ,用 MTT法检测化妆品作用后的模型细胞活性。 相对于阴性对照组织,活性低于60%时化妆品被判断为具有眼刺激性,活性高于60%时化 妆品被认为是无刺激性。 Kaluzhny 等人 9 报道了利用EpiOcular TM 进行眼刺激性试验(Eye Irritation Test) ,验证了 模型的整体精确度为88%,灵敏度和特异性分别达到了100%和 75%。2013 年,欧洲化妆品 (Cosmetic E
21、urope, formerly COLIPA) ) 报道了实验室间基于两种重建角膜上皮模型(Human Corneal Epithelium ,HCE) EpiOcula? 23和 SkinEthic? 在眼刺激性试验中具有良好的的重 复性 24 。陕西博溪生物科技有限公司也使用以中国眼角膜上皮细胞为种子细胞的的角膜上 皮模型对化学标准品进行了检测,结果与兔眼刺激一致,表明皮肤模型可用于体外眼刺激性 检测。 2.3 光毒性 光毒性是指皮肤一次接触光敏性化学物质后暴露于紫外线照射下所引发的局部或全身 的非免疫性毒性反应 25。其临床特征为出现晒斑、水疱等皮肤问题26 。现有的光毒性体外 评价方法
22、主要包括3T3 成纤维细胞中性红摄取光毒性试验(3T3 NRU-PT )、联合血红细胞 光毒性试验 (RBC-PT ) 和皮肤模型试验。3T3 NRU-PT 试验是唯一通过正式验证(OECD 432, 25)的体外方法, 但试验有一定的不足:(1) 测试使用细胞活力作为唯一的终点,仅可检测急 性毒性; (2) 无法分析毒性作用机制;(3) 测试显示高频率的阳性结果。 最早将三维皮肤模型应用于光毒性试验是在1994-1995 年间,主要采用了全层皮肤模型 和表皮模型。使用表皮模型进行光毒性检测,实验时先将受检物滴加于模型表面,然后暴露 于一定辐照剂量(通常为 1.7 mW/cm 2)的紫外线下一
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- 三维 重组 人工 皮肤 模型 化妆品 安全性 评价 中的 应用 分析
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