质粒载体的构建分析.pdf
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1、质粒载体的构建 摘要:质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的 基因序列和启动子序列设计引物,为提高目的基因产率,采用两次 PCR 的方法,即第一次设计引物扩增全序列基因,第二次设计带酶切 位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增,进而加尾连接到 T-DNA上 , 再 利 用 电 转 化 的 方 法 将 连 接 产 物 转 化 到 带 有 PCAMBIA1381 的 DH5感受态细胞中复制表达。 关键词 :质粒DNA PCR 电泳感受态转化 1. 引言 质粒( plasmid)是细菌或细胞染色质以外的,能自主复制的,与细菌或细胞共生的 遗传成分。其特点如下: 是染色质外的双链共价闭合环
2、形DNA (cccDNA ),可自然形成超螺旋结构,不同质 粒大小在2-300kb 之间, 15kb 的小质粒比较容易分离纯化,15kb 的大质粒则不易 提取。 能自主复制, 是能独立复制的复制子。一般质粒DNA 复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 质粒对宿主生存并不是必需的。 某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存,例如,细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因,如编码合 成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因,这种质粒称为抗药 性质粒,又称 R质粒,带有 R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的,而是共生的。 现在分子生物学使用的质粒
3、载体 都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒,而是经过了许多的人工的改 造。从不同的实验目的出发,人们设计了各种不同的类型的质粒载体。 质粒载体 pBR322 是研究得最多,是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载 体之一。符号质粒载体pBR322 中的“p代表质粒; “BR ”代表两位两位研究者 Bolivar 和 Rogigerus 姓氏的字首, “322”是实验编号。 质粒载体 pBR322 的大小为 4361bp, 相对分子质量较小的是它第一个优点。 优点之二是它带有一个复制起始位点,保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行 使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因,可供转化子的选择标记是它的第三
4、 个优点。 质粒载体 pBR322 的第四个优点是具有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增以后, 每个细胞中可累积1000-3000 份拷贝,该特性为重组体DNA 的制备提供了极 大的方便。 构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术,是在分子水平上提供一种纯 化和扩增特定 DNA 片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入 克隆载体, 形成重组克隆载体, 通过转化与转导的方式, 引入适合的寄主体内得 到复制与扩增, 然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到 插入 DNA 的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1 目的 DNA 的获得 2.1.1 引物设计
5、 第一次引物设计: 正向引物:sinn3F 冰盒标注: P2a 引物序列:5 AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3 引物长度: 25bp 反向引物: sinn3R 冰盒标注: P2b 引物序列: 5 GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA 3 引物长度: 22bp 第二次引物设计(带酶切位点) : 正向引物:sinn3FE 冰盒标注: P2c 引物序列: 5 ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3 引物长度: 34bp 反向引物: sinn3RE 冰盒标注: P2d 引物序列: 5 TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACG
6、TTTCTT3 引物长度: 34bp 2.1.2 PCR 扩增 2.1.2.1 PCR 技术的基本原理 PCR 即聚合酶链式反应,是指在 DNA 聚合酶的催化下,以母链 DNA 为模板 ,以特定引物 为延伸起点 ,通过变性、延伸、复性等步骤, 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 的过程 .是一项DNA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆,序列分析 ,基因表达调控,基因 多态性研究等许多方面. PCR 反应五要素:参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2 PCR 反应的基本步骤: 1.变性 : 高温使双链DNA 解离成单链 .(94 30s ) 2.退火 :低
7、温下引物与模板DNA 互补区结合形成杂交分子.(55 30s ) 3.延伸 :中温延伸 . 在 DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg 2+存在下 , DNA 聚合酶催化以引物为起 始点的DNA链 5 向 3 方向的延伸 ,合成出与模板DNA链互补的DNA子链 . (70-72 30-60s ) 以上三个步骤为一循环, 每一循环的产物均可作为下一循环的模板, 经过 n 次循环后 , 目的 DNA 以 2n形式增加 . 2.1.2.2 PCR检测 PCR 反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭 ,EB)染 色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此
8、引物两聚体 等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法 2.1.2.3 PCR反应体系 第一次 PCR扩增: 调整 PCR反应体系中各成份、组成及反应条件 ,经多次反复试验结 果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA 电泳条带( 1kb): PCR反应体系 2*100ul(每管 25ul, 共 8 管) Pyrobest 2ul buffer(10x) 10ul WT4(模板) 2ul P2a(10uM ) 4ul P 2b(10uM ) 4ul dNTP(2.5x ) 2ul ddH2O 76ul PCR反应条件 : 94 5min 30 cycles: 94
9、40s 53 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(方法见 2.1.3 电泳), 切胶回 收目的 DNA 条带, 共切 3 管, 分别标注 A、B、C.首先用 25ul 约 60的 无菌蒸馏水洗脱 A管一次, 洗脱液标注 1, 分别用 15ul 的无菌蒸馏水 洗脱 B管和 C管, 得到的 DNA 洗脱液标注 2, 最后各用 30ul 的无菌蒸 馏水洗脱 A、B、C管, 得到的 DNA 洗脱液分别标注a、b、c. 第二次 PCR扩增(带酶切位点) : 分别用 DNA 的洗脱液 2、a、b、c 为模板 , 进行第二次 PCR扩 增,设计反
10、应体系(各25ul )如下: 模板 2 模板 a 模板 b 模板 c Pyrobest 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul buffer(10x) 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 模板 0.5ul 2ul 4ul 6ul P 2a(10uM ) 1ul 1ul 1ul 1ul P2b(10uM ) 1ul 1ul 1ul 1ul dNTP(2.5x ) 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul ddH2O 19ul 17.5ul 15.5ul 13.5ul PCR反应条件 : 94 5min 30 cycles: 94 40s 54 40s 72 2min30
11、s 72 10min 4 forever 电泳结果表明 : 以 2 管和 c 管为模板可得到明显的目的基因条带, 依据此次电泳结果 ,可先后再利用 PCR扩增(各 100ul, 每管 25ul, 共 8 管) PCR反应体系 2*100ul(每管 25ul, 共 8 管) 模板 2 模板 c Pyrobest 2ul 2ul buffer(10x) 10ul 10ul 模板 4ul 40ul P2a(10uM ) 4ul 4ul P2b(10uM ) 4ul 4ul dNTP(2.5x ) 2ul 2ul ddH 2O 74ul 38ul PCR反应条件 : 94 5min 30 cycles
12、: 94 40s 54 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever 电泳条带明显而且明亮 , 切胶回收保存待用 .。 2.1.3 电泳 2.1.3.1 配胶 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(1X TAE Buffer ) 根据制胶量和凝胶浓度,准确称量琼脂糖粉(1g), 加入适当 的锥形瓶中。 加入一定量的电泳缓冲液(1X TAE Buffer 100ml) 。 熔化完全,冷却至600C 左右,加入 EB5- 7ul,充分混匀。 将溶液倒入制胶模中,之前应在适当位置插上梳子。 室温下凝固,不立即使用时, 可用保鲜膜将凝胶包好后放40C 保存,一般可保存2-5 天。 2.
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- 质粒 载体 构建 分析
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