2019-2020学年高中生物新同步沪科版选修1学案:第1章 第3节 测定微生物的数量 Word版含解析.doc
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1、第 - 10 - 页 共 10 页第三节测定微生物的数量一、测定微生物数量的方法测定微生物数量的方法可分为两类:直接计数法和间接计数法。前者常用的是显微镜直接计数法,这种方法是先将待测样品制成悬液,然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。后者最常用的是稀释平板计数法,需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内,经培养后统计培养基中出现的菌落数,从而推算出样品中的活菌数。利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些?【提示】血球计数板测出的是全部菌体数,而平板计数法只能测出活菌数,而且比实际数偏少。二、间接计数法的实
2、验设计1制备土壤稀释液取土壤表层510 cm处的土样。准确称取1 g土样,放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中,振荡20 min后制成102倍的稀释液。然后进行系列稀释,得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。2取样及倒平板3培养4观察记录(1)计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30300个菌落为宜,霉菌以每个培养皿内有10100个菌落为宜。(2)计算每克样品菌数公式:每克土壤样品菌数稀释倍数。一、微生物生长量的测定1.测重量法 干重法:将单位体积待测的培养液离心后,用清水洗涤15次,放入干燥器中加热干燥,加热温度一般在100105 之间,再称重。以细菌为例,一个细胞一般重约10
3、121013g,也可在较低温度(如40 )下进行真空干燥。湿重法:将一定量的菌悬液离心或过滤,得到菌体,反复洗涤后称湿重,干重一般为湿重的20%25%。2计数法(1)直接计数法这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室,在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格,每个中格进一步划分成16个(或25个)小格,但计数室都由400个小格组成。将稀释的样品滴在计数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜下计数45个中格的细菌数,并求出每个小格所含细
4、菌的平均数,再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。(2)间接计数法(活菌计数法)稀释平板涂布法,常用来统计样品中的活菌数。此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时先将待测样品做一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿上,使其均匀分布于平板中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。说明:为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300个的平板进行计数。将待测样品经一系列10倍稀释,然后选择三个稀释度的
5、菌液,分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上,然后用无菌玻璃涂棒将菌液涂布在整个平板表面,放入适宜的温度下培养计算菌落数。为使结果接近真实值可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板中,经涂布、培养计算出菌落平均数。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。因此,统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要,一般以三个稀释度中的第二个稀释度平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。每克样品中的菌落数(CV)M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M
6、代表稀释倍数。二、测定土壤中的微生物数量土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的,这些数量众多的微生物对提高土壤肥力有重要作用。因此,测定土壤的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。1实验原理平板菌落计数法是将待测定的微生物样品按比例做一系列稀释后,将其中的微生物充分分散成单个细胞,吸取一定量某几个稀释度的菌液接种到平板上,培养一段时间后,每个单细胞生长繁殖形成单个菌落,根据稀释倍数、取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。2材料用具土壤样品:尿素,酵母粉,磷酸二氢钾,磷酸氢二钠,酚红,琼脂,1 mol/L NaOH溶液,无菌吸管,盛有9 mL无菌水的试管,盛有90 mL无菌水并带有玻璃
7、珠的锥形瓶,试管架,无菌培养皿,记号笔,烧杯等。3方法步骤(1)制备尿素固体培养基准确称取尿素20 g,酵母粉0.1 g,磷酸二氢钾9.1 g,磷酸氢二钠9.5 g,酚红0.01 g,琼脂20 g,依次加入盛有900 mL 蒸馏水的烧杯中,加热溶解后,用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.27.4,补加蒸馏水至1 000 mL。(2)制备土壤样品稀释液称取土样10 g,放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中,振荡约20 min,使土样和水充分混合,将土壤悬液制成101、102、103、104、105、106不同稀释度的稀释液。制备土壤样品稀释液时应注意每个吸管只能接触一个浓度的稀释
8、液,且取样前需充分摇匀。(3)加样取10套无菌培养皿,取104、105和106每种稀释度的稀释液做3个重复平板,留下一个平板作空白对照。分别用1 mL无菌移液管精确吸取104、105、106三个稀释度的菌悬液各0.2 mL,加至相应编号的无菌培养皿中(如图)。微生物数量测定的流程图(4)倒平板将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至45 左右的尿素培养基(倒入量约15 mL),随即快速晃动培养皿,使菌液和培养基充分混匀后平置,待凝。(5)培养待平板完全凝固后,倒置于恒温箱中37 培养。(6)统计菌落数培养48 h后取出平板,统计各皿中的菌落数,将结果记录在表格中,计算结果时,应选取每皿菌落数在3
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