2020版生物新导学浙江选考大一轮讲义:第30讲 微生物的利用 Word版含解析.pdf
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1、第第 30 讲 微生物的利用讲 微生物的利用 考纲要求 1.大肠杆菌的培养和分离。2.分离以尿素为氮源的微生物。 考点一 微生物的培养和分离考点一 微生物的培养和分离 1.培养基与无菌技术 (1)培养基 含义微生物生存的环境和营养物质 成分 水、无机盐、碳源和氮源,还需满足不同微生物生长对 pH、特殊营养物质 以及氧气的要求 LB 培养基:蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水、琼脂(固体培养基) 各成分 的作用 蛋白胨、酵母提取物:为细菌生长提供碳源和氮源 氯化钠:维持一定的渗透压 琼脂:凝固剂,不易分解,一般不作为营养物质。其在 96 时融化成液体, 冷却到 45 以下即重新凝固 种类 按物理状态
2、分:固体培养基、半固体培养基、液体培养基 按特殊用途分:基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基 按培养的微生物分:细菌培养基(pH 呈中性偏碱,添加有机物如蛋白胨、酵 母提取物,还要添加氯化钠以维持渗透压)、霉菌培养基(pH 呈中性偏酸,添 加无机物或添加蔗糖的豆芽汁) (2)灭菌操作 项目灼烧灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌 适用材料 或用具 接种环、 接种针或 其他金属用具 培养基、培养皿、试管等玻璃器具等 尿素等加热会 分解的物质 灭菌条件 及时间 在酒精灯火焰上 充分灼烧, 直至烧 红,冷却后备用 LB 培养基:121 (1 kg/cm2压力)、 15 min 含葡萄糖的培养基:90
3、以上 (500 g/cm2压力)、30 min 玻璃器皿:高压蒸汽灭菌后放入 6080 烘箱中烘干 G6 玻璃砂漏斗 过滤 2.大肠杆菌的培养和分离 (1)大肠杆菌 特性:大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(代谢类型)的肠道杆菌,在肠道中一般对人无害, 但若进入人的泌尿系统,就会对人体产生危害。 用途:是基因工程技术中被广泛采用的工具。 (2)细菌的培养和分离 细菌的繁殖:以分裂的方式繁殖,分裂速度很快,约 20 min 分裂一次。 培养的方法:需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中,一般用接种环(工具)转移带 菌的培养物。 细菌分离的方法与特点 分离方法特点 划线分离法操作简单 涂布分离法操作
4、复杂,单菌落更易分开 (3)大肠杆菌的培养和分离实验 实验内容:将大肠杆菌扩大培养和划线分离,即用 LB 液体培养基扩大培养大肠杆菌,培 养后再在 LB 固体平面培养基上划线进行分离,随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。 实验步骤 50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基及培养皿进行高压蒸汽灭菌 将培养基分别倒至 4 个灭菌后的培养皿中,水平放置,使之形成平面 在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌,培养 12 h 用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次,在固体培养基的平板 上连续划线,盖好培养皿 培养基灭菌 倒平板 接种 培养皿倒置(盖在下面),放在 37 恒温培
5、养箱中培养 1224 h 后,可看到 划线分离 培养观察 划线的末端出现不连续的单个菌落 大肠杆菌分离的用途:单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量 菌株的最简便方法之一。 3.微生物两种常用的接种方法比较 比较划线分离法涂布分离法 工具接种环玻璃刮刀 原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面 连续划线的操作,将聚集的菌种逐 步稀释分散到培养基表面。在数次 划线后培养,可以分离到由一个细 菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞 群体,即菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释, 然后将不同 稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基 的表面, 进行培养。 在稀释度足够高的菌液 里, 聚集在一起的微生
6、物将被分散成单个细 菌细胞, 从而能在培养基表面形成单个的菌 落 特点方法简单,但不适宜计数单菌落更易分开,但操作复杂些 目的使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落 (1)玻璃砂漏斗用后需用 1 mol/L 的 HCl 浸泡,并抽滤去酸,再用蒸馏水洗至洗出液呈中性, 干燥后保存( ) (2)科研人员在超净台上进行接种操作时,为了保证无菌环境,打开紫外灯和过滤风( ) (3)倒平板时,应将打开的培养皿盖放到一边,以免培养基溅到培养皿盖上( ) (4)用涂布分离法纯化大肠杆菌时, 只要稀释度足够高, 就能在培养基表面形成单个菌落( ) (5)划线分离法简单并且可以用来计数, 涂布分离
7、法使单菌落更易分开, 但操作复杂些( ) (6)微生物的分离和培养实验结束后,将培养基倒入废料桶并用清水将器皿清洗干净( ) (7)下图中甲为划线分离法中最重要的环节,乙为操作的结果: 每一次划线后都要灼烧接种环( ) 除第一次划线外,每一次划线的起点都是第一次划线的末端( ) 观察甲、乙、丙、丁四幅图和两种接种方法接种后培养的效果图,请思考: (1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程:丙乙甲丁。 (2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。 (3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。 (4)下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请思考: 获得图 A 效果和 B 效果的
8、接种方法分别是什么? 提示 获得图 A 效果的接种方法为涂布分离法,获得图 B 效果的接种方法为划线分离法。 某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是什么? 应当怎样操作才可避免此种现象? 提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌。应采取 的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。 1.(2018杭州一模)据报道,一些企业生产的速冻食品中检出金黄色葡萄球菌超标,加上熟卤 制品的大肠杆菌超标,“细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的 卵磷脂,在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳
9、浊环。请回答下 列问题: (1)某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。 配制培养基:称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等,加入蒸馏水,搅拌加热至完全 溶解后_,分装到锥形瓶后利用_进行灭菌,在无菌状态下加入 卵黄液(100 mL 10%灭菌 NaCl 溶液中加一个鸡蛋黄,振荡均匀)摇匀后立即倒平板。 接种:该小组采用涂布分离法检测果汁样品中的细菌含量。在涂布接种前,随机取若干灭 菌后的空白平板先行培养了一段时间,这样做的目的是_;然后, 将 1 mL 果汁样品稀释 10 倍,在 3 个平板上用涂布分离法分别接入 0.1 mL 稀释液。 培养及结果:将培养
10、皿_放入恒温培养箱中经适当培养,3 个平板上的菌落数 分别为 19、18 和 17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为_个。 (2)示意图 A 和 B 中_表示的是用涂布分离法接种培养后得到的结果。 (3)下列有关常用涂布分离法的操作正确的是_。 A.在超净工作台中进行接种时应关闭紫外灯 B.接种前需先稀释,然后过滤除去杂菌 C.在每个固体培养基表面都可形成单菌落 D.玻璃刮刀浸泡在 70%的酒精中灭菌,不用灼烧 (4)菌种保存:在无菌条件下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在_上,在 37 下培养 24 h 后,置于 4 冰箱中保存。 答案 (1)调节 pH 高压蒸汽灭菌锅 检测培养基平板
11、灭菌是否合格 倒置 1.8106 (2)B (3)A (4)斜面 解析 (1)培养基配制好后应调节酸碱度(pH),分装到锥形瓶后利用高压蒸汽灭菌锅进行灭 菌。 涂布接种前, 将制好的空白平板先培养一段时间, 目的是检测培养基平板灭菌是否合格 ; 接种后, 培养皿需要倒置培养, 防止皿盖上凝集的水滴滴落造成污染 ; 0.1 mL 稀释液(稀释 10 倍)含细菌数约为 18 个,得出每升果汁含有活菌数 1.8106个。(2)图中 A 为划线分离得到的 结果,B 为涂布分离得到的结果。(3)在超净工作台进行接种操作时应关闭紫外灯,A 正确; 涂布分离前需稀释, 但不能过滤除菌, B 错误 ; 稀释度
12、较大的溶液涂布分离不一定出现单菌落, C 错误;玻璃刮刀浸泡后需要灼烧,D 错误。(4)纯化的菌种保存在斜面上。 2.(2018宁波 3 月联考)研究小组从土壤中筛选以多环芳烃(PAHs)为碳源和能源的细菌,用以 降解工业废水和生活污水中的 PAHs。请回答: (1)为了从土壤中筛选 PAHs 降解菌,需配制以_为唯一碳源的培养基,培养基 经_A.121 (500 g/cm2压力),15 min B.90 (500 g/cm2压力),15 min C.121 (1 kg/cm2压力),15 min D.90 (500 g/cm2压力),30 min高压蒸汽灭菌,待冷却至 60 后倒平板。 (2
13、)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰,目的是_。在倒平板的过程 中,如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,则这个平板不能用来培养 PAHs 降解菌,原因 是_。 (3)制备土壤稀释液时,用_法接种于固体培养基表面;培养时,需将培养皿_ 并放在 37 恒温培养箱中培养 24 h。 (4)用划线分离法纯化 PAHs 降解菌的过程中,在第二次及其后的划线操作时,应从上一次划 线的末端开始划线,原因是_。 答案 (1)PAHs C (2)防止杂菌污染 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上 滋生 (3)涂布分离 倒置 (4)使细菌数量随着划线次数的增加而逐渐减少, 最终得到由单个 细菌繁殖而成的菌落
14、 解析 (1)为了筛选以 PAHs 为碳源的细菌,应保证培养基中 PAHs 为唯一碳源;配制好的培 养基经高压蒸汽灭菌法灭菌,温度为 121 (1 kg/cm2压力),灭菌 15 min。(2)倒平板时使锥 形瓶的瓶口通过火焰,目的是防止杂菌污染。若培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,则空气 中的微生物可能在此部位的培养基上滋生,故该平板不能使用。(3)土壤稀释液用涂布分离法 接种,培养皿需倒置培养。(4)划线分离法中第二次及其后的划线操作要从上一次划线的末端 开始,原因是上一次划线末端菌数减少,有利于进一步分离。 3.(2019舟山质检)下列是有关大肠杆菌的培养实验,请回答问题: (1)配制培养
15、大肠杆菌的培养基时,根据“细菌喜荤,霉菌喜素”的规律,通常在培养基中加 入蛋白胨和_作为营养物质,为维持一定的渗透压,常需加入一定量的_。 (2)大肠杆菌的培养和分离实验中, 在_中进行扩大培养, 培养液经_后, 在 LB 固体培养基上进行_,并将培养皿_放在恒温培养箱中培养,可以获 得如图所示效果。为了检测接种、培养过程是否受到杂菌污染以及_,应同时 将未接种的培养基放入相同条件的恒温培养箱中培养。 (3)依据_的形状、大小等特征对获得的纯菌种进行初步的鉴定。 (4)下列关于“大肠杆菌的培养和分离”的操作中,叙述正确的是_。 A.高压蒸汽灭菌加热结束时,打开放气阀使压力表指针回到零后,开启锅
16、盖 B.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上 C.为了防止污染,接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 D.用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上 答案 (1)酵母提取物 NaCl (2)LB 液体培养基 稀释 分离 倒置 无菌操作是否规范 (3)菌落 (4)D 解析 (1)配制培养大肠杆菌的培养基时,根据“细菌喜荤,霉菌喜素”的规律,通常在培养 基中加入蛋白胨和酵母提取物作为营养物质, 为维持一定的渗透压, 常需加入一定量的 NaCl。 (2)大肠杆菌的培养和分离实验中, 在 LB 液体培养基中进行扩大培养, 培养液经稀释后, 在 LB 固体培养基上进行分离,并将培养皿
17、倒置放在恒温培养箱中培养;为了检测接种、培养过程 是否受杂菌污染以及无菌操作是否规范,应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱中培养。 (3)依据菌落的形状、 大小等特征对获得的纯菌种进行初步的鉴定。 (4)高压蒸汽灭菌加热结束, 等待压力表指针回到零后,才能打开放气阀,开启锅盖,不能直接打开放气阀使压力表指针 回到零,A 错误;倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖,以防止杂菌污染,B 错误;接种环 在火焰上灼烧后,待冷却后才可以快速挑取菌落,C 错误;用记号笔标记培养皿中菌落时, 应标记在皿底上,D 正确。 1.对无菌操作的理解 (1)灭菌的原因:为了获得纯净的培养物,防止外来杂菌的污染。 (2)无
18、菌操作的条件:各种器皿必须无菌;培养基必须无菌;细菌接种、转移等操作过程必须 无菌。 (3)避免培养物被杂菌污染的方法 注意灭菌操作原则,灭菌彻底,降低环境污染概率,手和实验服要清洁,减少操作时间, 胆大心细。 注意微生物的生长条件,如 pH、渗透压、温度等。“细菌喜荤,霉菌喜素” ,细菌喜欢在 中性偏碱的环境中生长,霉菌喜欢在中性偏酸的环境中生长。因此,可根据不同微生物的 “喜好”来减少污染。 2.划线分离操作中的有关问题 (1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结束后,仍然需要灼烧接 种环。 第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧 目 的 避免接种环上可能存在 的微生
19、物污染培养物 杀死上次划线结束后 接种环上残留的菌种 杀死接种环上残留的菌种, 避免细菌污染环境或感染 操作者 (2)在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高,杀死菌种。 (3)在进行第二次以及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后,线 条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始划线,能使细菌的数目 随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 3.进行恒温培养时,要将培养皿倒置的原因 如果正放培养皿, 则皿盖上形成的水滴会落到培养基表面并且扩散开, 会冲散菌体, 污染菌落, 达不到分离的目的,因此恒温培养时,培养
20、皿必须倒置。 考点二 分离以尿素为氮源的微生物考点二 分离以尿素为氮源的微生物 1.菌种特点 含有脲酶,可以通过降解尿素作为其生长的氮源。 2.培养基 用以尿素为唯一氮源的培养基培养,以 LB 全营养培养基为对照。 3.实验原理 (1)筛选以尿素为氮源的微生物,可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。 (2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成 NH3,致使 pH 升高,使酚红指示剂变红。 4.实验步骤 5.反应的鉴定 在配制培养基时,加入指示剂酚红,培养时细菌将尿素分解并产生碱性的氨,使培养基上菌 落周围出现红色的环带。 (1)分离以尿素为氮源的微生物时,配制的培养基中加入酚红作为酸碱指示剂
21、,加入琼脂作为 凝固剂( ) (2)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( ) (3)从物理性状的角度看,选择培养基多属于固体培养基( ) (4)对细菌进行计数只能采用涂布分离法,而不能用划线分离法( ) (5)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源( ) (6)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的酸碱度降低( ) 如图为分离以尿素为氮源的微生物的实验,思考回答下列问题: (1)实验目的是使用含有尿素的培养基分离能产生脲酶的细菌,使用酚红作为指示剂。 (2)有脲酶的细菌菌落周围出现有色环带的原因是什么? 提示 细菌向胞外分泌脲酶,使培养基中尿素水解产生呈碱
22、性的氨,遇培养基中的酚红指示 剂产生颜色变化,形成红色环带。 (3)制备尿素固体培养基的过程中采用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌法、G6 玻璃砂漏斗过滤法。 (4)从上图所示实验过程中可判断出细菌悬液 C 的稀释度为 104。 1.幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并 制成菌液后,进行分离培养。实验基本步骤如下: 配制培养基灭菌、倒平板X培养观察 请回答下列问题: (1)在配制培养基时,要加入尿素和酚红指示剂,这是因为 Hp 含有_,它能以尿素作 为氮源;若有 Hp,则菌落周围会出现_色环带。 (2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。 A.高压蒸
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