第三节染色体自主复制序列的分离与鉴定.ppt
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1、第三节 染色体自主复制序列的 分离与鉴定,一分离ARS的一般程序 染色体DNA限制酶切与整合型载体连接转化相应的宿主细胞分离纯化转化体*分离各转化子总DNA转化E.coli药物抗性菌落分离质粒DNA重新转入宿主细胞高频重组转化体 *在获得第一次转化体后,可利用下述方法淘汰掉全部因整合作用所形成的转化体:,转化体菌落点种在合成和完全培养基上的同一位置培养将完全培养基平板上的菌落影印到另一个合成培养基平板上培养比较两个合成培养基平板上生长的菌落,挑选那些在第二个合成培养基平板上不生长的相应位置上的菌落(从第一个平板上挑取),二ARS的分析与鉴定 1限制酶谱与次克隆 2. 倒位分析,3. 插入分析:
2、将1.4Kb EcoRI片段分离出来,插入另一个整合载体,其重组DNA分子的转化频率可大大提高,4. 定位分析,5. 遗传稳定性分析 6. DNA序列分析 用ARS DNA作探针与染色体DNA杂交,只能有一杂交带出现,这表明各ARS顺序之间不能发生交叉杂交,但不同的ARS显然只能利用同种DNA聚合酶。 核苷酸顺序测定结果表明,来自不同的ARS顺序含有11个核苷酸的保守序列: A(T) TTTATA(G)TTTA(T) AT含量几乎为100% 该保守序列位于一富含AT的区域内,其长度为100 bp,AT含量为79%。ARS1的结构分析表明,它由两个组件构成。组件A决定高频转化,但自由复制有限,而
3、组件B可提高组件A的复制效率,但它本身不能自主复制。 *利用上述方法分离自不同生物的ARS,当放回原来生物时不一定能自主复制,第四节 着丝粒DNA的分离与鉴定,一分离着丝粒的方法与步骤 1. 染色体巡查法 先利用遗传互补法和免疫筛选法分离靠近着丝粒的各个基因,然后用染色体巡查的方法去筛选那些在有丝分裂和减数分裂中十分稳定的重组质粒,这种方法特别适合于那些遗传学图谱已经清楚的着丝粒的分离,其一般过程如下: 遗传互补法 染色体DNA组建基因文库 分离与着丝粒两端或与着丝粒连锁 免疫筛选法 的基因 染色体巡查检测各重组DNA分子的遗传稳定性进一步确证与鉴定 酵母染色体3、4、6和11上的着丝粒就是利
4、用该法分离到的,2.直接筛选法 该法适用于那些着丝粒与已知基因相距较远的或连锁关系不太清楚的着丝粒的分离。这种分离方法所依赖的原理之一是当一自主复制型载体插入一段含着丝粒的DNA片段后,其稳定性大大增加,而质粒的拷贝数将降为1-2。其分离程序: 染色体DNA部分限制酶切与自主复制载体相连转化相应突变体转化体培养在完全培养基上涂布在合成培养基上纯化转化体分离总DNA转化E.coli抗性转化体分离质粒DNADNA杂交进一步鉴定 限制酶切电泳Southern杂交 酿酒酵母的CEN5便是利用此方法分离到的, 该法也适用于任何着丝粒DNA的分离。,二着丝粒DNA的鉴定方法 1. 稳定性分析 1) 有丝分
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- 三节 染色体 自主 复制 序列 分离 鉴定
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