Vero细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定.pdf
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1、武汉生物制品研究所 硕士学位论文 Vero细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定 姓名:姜志军 申请学位级别:硕士 专业:病原微生物学 指导教师:方志正 20070501 武汉生物制品研究所硕士论文 V e t o 细胞低血清适应株的驯化,建库及鉴定 论文 V e r o 细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定 摘要 本文报导了逐步降低小牛血清含量以驯化培养非洲绿猴肾细胞( V e r o 细胞) 低 血清适应株,建立工作细胞库及检定。使用复苏保存于本所狂犬疫苗室的第1 3 2 代 V e r o 细胞和使用1 9 9 培养基,通过逐步降低细胞培养液中小牛血清的含量,让V e r o 细胞逐步适应低血
2、清的培养环境。选择生长情况最好的细胞,增殖一定量的细胞, 保存于液氮中建立工作细胞库;并按照中华人民共和国药典第三部上的方法对 工作细胞库进行了全面检定;以及与本所生产所用的V e r o 细胞同时接种狂犬病毒用 免疫荧光定量法比较收获的病毒原液滴度。经试验显示,细胞鉴别试验证实其染色 体数目为5 3 6 l 条,符合于V e r o 细胞核型特点;细菌、真菌检查证实无菌污染; 支原体检查证明无支原体污染;外源因子检查证实无外源因子污染;用R T - P C R 法 检测证实无逆转录酶活性;对第1 6 5 代细胞进行致瘤性检查证实无致瘤性。接种狂 犬病毒测量滴度显示:该V e r o 细胞低血
3、清适应株产生狂犬病毒滴度低于生产所用 V e r o 细胞,但其滴度大于6I g L D 如符合药典规定可用于疫苗生产。该细胞库各项 指标均符合于中华人民共和国药典三部2 0 0 5 年版生产用动物细胞基质检定规程 的要求,可以作为疫苗生产的被选细胞。该2 血清适应株连续培养3 0 代以上及冻 存后复苏4 次,细胞均生长稳定。 关键词:V e r o 细胞低血清适应工作细胞库检定 3 武汉生物制品研究所硕士论文V e t o 细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定 A B S T R A C T T h eV e r oc e l ls t r a i na d a p t i n gl o wS
4、 mc u l t u r ew a st a m e db yg r a d u a l l yr e d u c e dc a l f s e r u m sc o n t e n ti nc u l t u r es o l u t i o n T h eV e r oe e l ls t r a i nW a sb ec h a r a c t e r i z e da n df o r m e d aw o r k i n gc e l lb a n kt W C B ) i nt h i st h e s i s W et h a w e dt h eV e r oc e l lo
5、 f1 3 2g e n e r a t i o n w h i c hW a Sf r o z e ni nt h er a b i e sv a c c i n ed i v i s i o n , a n de n i t u r e di tw i t ht h e1 9 9m e d i u m B y g r d u a l l yr e d u c e dc a l f s e r u m Sc o n t e n ti nt h ec e l lc u l t u r ef l u i dS Oi t st h eV e t oc e l lc a na d a p t t h
6、 ec i r c u m s t a n c eo f l o ws e r u m S e l e c t e dt h ec e l lo f t h eb e s tg r o w t hs t a t ea n dp r e s e r v e di n t h el i q u i dn i t r o g e nt of o r maw o r k i n gc e l lb a n k A c c o r d i n gt ot h em e t h o df r o mt h et h i r d r e g i o n o fP h a r m a c o p o e i
7、ao ft h e P e o p l e sR e p u b l i co fC h i n a , t h eW C Bw a sb e c h a r a c t e r i z e d T h ec e l li d e n t i t yt e s ts h o w e dt h en u m b e ro fc h r o m o s o m e so ft h ec e l li s b e t w e e n5 3a n d6 1a n dc o r r e s p o n dt h ek a r y o t y p eo fV e r oc e l l T h es t e
8、 r i l i t yt e s ta n d m y c o p l a s m at e s t i n gd e m o n s t r a t e dt h e r ei s n op o l l u t i o no fb a c t e r i u m , e u m y c e t ea n d m y c o p l a s m a A d v e n t i t i o u sv i r u s e sw e r en o td e t e c t e di nc u l t u r eb yt e s t i n gf o ra d v e n t i t i o u s
9、 a g e n t s I tw a sm a n i f e s t e db yR T - P C Rm e t h o dt h a tt h e r ei sn op o l l u t i o no fr e u o v i r u s T h e t u m o r i g e n i c i t yt e s t i n gi nt h ec e l lo f1 6 5g e n e r a t i o nd i s c o v e r e di th a sn ot u m o r i g e n i c T h e t i t e ro fr a b i e sv i r
10、u ss t o c ks o l u t i O l lo ft h eV e r oe e l I 、i t h3 c a l fs a u mc u l t u r ei s1 0 w e r t h a nt h et i t e ro fV e r oc e l lw i t h8 c a l fs e r u mc u l t u r e B u ti t st i t e ri sa b o v e6l g L D s 0a n d a c c o r d i n gt h eP h a r m a c o p e i ao fC h i n a ( 2 0 0 5 ) i tc
11、 缸b ea c t 船c e l ls u b s t r a t ei nv a c c i n e p r o d u c t i o n A l lo ft h ei t e m so fW C B a r eq u a l i f i e da c c o r d i n gt ot h er e g u l a t i o no fa n i m a l c e l ls u b s t r a t ei nt h et h i r dr e g i o no f P h a r m a c o p o e i ao f t h eP e o p l e SR e p u b l
12、i co f C h i n a T h e V e r oc e l la d a p t i n g2 c a l fs e r u mw a sp a s s a g eo v e r3 0g e n e r a t i o n sa n db et h a w e df o u r t i m e s ,t h ec e l lg r e ws t a b l y K E YW O R D S :t h eV e r oc e l lc e l ls t r a i no fa d a p t i n gl o wS C R I mc u l t u r e w o r k i n g
13、c e l l b a n k ( W C B ) i d e n t i f y 4 武汉生物制品研究所硕士论文 V e t o 细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定 1 上j L 刖舌 动物细胞培养开始于上世纪初。1 9 6 2 年,其规模开始扩大,发展至今已成为生 物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用动物细胞培养生产具有重要医用 价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要组成部分, 已占世界生物高技术产品市场份额的5 0 以上【l 】。 V e r o 细胞是一种源于非洲绿猴肾的传代细胞系,是一种理想的疫苗生产基质: 遗传背景清楚,核型稳定,无外源因子污染,1
14、 6 5 代以内没有致瘤性,适合大规模 培养,可用生物反应器生产,保证了疫苗的均质性和安全性。目前。V e r o 细胞已被 W H O 和我国药品监督管理局认可,用于生物制品的生产用传代细胞【2 1 。目前,我国 已正式生产V e t o 细胞狂犬病疫苗、乙型脑炎灭活疫苗。其它正在开发、研究和生产 的疫苗有流感疫苗、出血热疫苗、甲肝疫苗、轮状病毒疫苗、S A R S 疫苗等等。 病毒性疫苗的生产,其必需的途径是细胞的大规模培养。而大多数的动物细胞 在进行体外培养时仍需采用含血清的培养基。目前V e t o 细胞培养通常采用含8 - 1 0 小牛血清的培养液进行培养。血清是一种很复杂的混合物,
15、其组成成份为一些细胞 生长所必需的生长因子、激素、脂质、结合蛋白和多种微量元素等。虽大部分已为 人所知,但还有一部分尚不清楚,而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、 生理条件和营养条件不同而异1 3 】。每个批次的血清之间存在批间差异,容易被病毒 和支原体感染,此外血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子和单克隆抗体 等细胞产品的分离纯化带来很大的困难。同时,血清中也含有一些抑制细胞增殖的 物质【4 】,且血清价格较昂贵。 基于这些不利因素,以及近年来对生物制品安全性要求的不断提高,在生产过 程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势【5 1 。美国F D A 和美国农业部已经严密 控制
16、在细胞培养中牛血清的使用,以降低动物血清可能携带的传染源对细胞系和制 品带来的风险。近年来许多厂家研制出无血清培养基来代替小牛血清,避免了由血 清造成的许多问题。由于无血清培养基可完全采用已知分子结构或构型组分的低蛋 白,甚至完全不采用蛋白组分,因此被广泛应用于细胞工程领域。在细胞工程中用 于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品是无血清培养基最重要的应用。 这是因为一方面无血清培养基的成分相对明确、质量一致且蛋白质含量低,因而有 5 武汉生物制品研究所硕士论文V e t o 细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定 利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化:更为重要的一方面是可以 通
17、过对无血清培养基成分的优化,使不同的细胞能各自在最有利于其生长或最有利 于表达目的产物的环境中持续高密度培养。 但是无血清培养基的缺点也是显而易见的,其缺点主要体现在以下几个方面: l 、无血清培养基的通用程度不高。不同类型的细胞、甚至不同的细胞系或细胞 株都可能有各自的无血清培养基,对无血清培养基的适应往往是克隆特异性的f 们。 2 、无血清培养基与发酵罐技术的结合应用时存在着一定困难。细胞在不同的培 养方式下对无血清培养基的要求会不相同,适合转瓶培养的无血清培养基简单放大 到发酵罐培养并不一定合适见 3 、目前采用贴壁培养的工程细胞株其微载体等贴壁介质成本很高,且因为流体 力学效应和细胞生
18、长的限制而难以实现长期连续高密度培养。 4 、细胞在无血清培养液中通常生长缓慢,有限细胞系的传代次数也减少f 4 J 。 5 、价格昂贵,通常无血清培养基的价格比普通培养基要昂贵许多。 正是因为上述种种原因,本文试图探索一种采用基础培养基( 1 9 9 培养基) 中 逐渐降低小牛血清用量来驯化V e t o 细胞适应株的方法,并按中华人民共和国药典 三部上的规定【s 】将驯化的细胞株建立了工作细胞库。为进一步减少小牛血清在疫 苗生产中的使用提供了一个参考方案。 6 武汉生物制品研究所磺士论文V e t o 细胞低血清适应株的驯化、建库及鉴定 试验一、V e r o 细胞低血清适应株的驯化、建库
19、与检定 材料和方法 一、材料 ( 一) 细胞系: l 、V e r o 细胞,即非洲绿猴肾细胞,狂犬病毒疫苗生产细胞株。本所狂犬疫苗室 保存的细胞株来自中国药品生物制品检定所的1 2 6 代V e r o 细胞,经扩增传代后 制备主细胞库和生产细胞库。经外源因子检测、染色体检查、致肿瘤性检查,证 明无细菌、霉菌及病毒污染,至1 6 5 代培养未见致肿瘤性,符合W H O 狂犬病专 家委员会制定的关于应用传代细胞制备疫苗的规程及中国生物制品规程要求。 取生产细胞库冻存的1 3 2 代细胞,经复苏传代后用于试验。 2 、2 B S 细胞,即人胚肺细胞,取自本所病毒疫苗研究室。 3 、V e t o
20、 E 6 细胞,取自本所狂犬疫苗室。 4 、H e l a 细胞,人宫颈癌细胞系,取白华中科技大学同济医学院病理教研室。 5 、3 T 3 细胞,小鼠成纤维细胞,取自本所免疫研究室。 ( 二) 动物: l 、乳鼠,出生2 4 小时内,由本所实验动物中心提供。 2 、小鼠,1 5 2 0 克,由本所实验动物中心提供。 3 、鸡胚,S P F 级别,5 - 6 日龄,由本所实验动物中心提供。 4 、鸡胚,S P F 级别,9 1 1 日龄,由本所实验动物中心提供。 5 、豚鼠,3 5 0 5 0 0 克,由本所实验动物中心提供。 6 、家兔,1 5 2 5 公斤,由本所实验动物中心提供。 ( 三)
21、 主要器材: l 、生物安全柜:型号L 4 3 0 6 0 0 E ,美国N U A I R 公司产品。 2 、二氧化碳培养箱:美国F o r m aS c i e n t i f i c 产品。 3 、液氮罐:U n i b o n 公司产品。 4 、倒置显微镜:C O I C 型,重庆光学仪器厂产品。 5 、普通显微镜:德国莱卡公司产品。 7 武汉生物制品研究所硕士论文 V e t o 细胞低血清适应株的驸化、建库及鉴定 6 、低速台式离心机:T D L - 4 0 0 0 B C 型,上海申光仪器仪表有限公司产品。 7 、电热恒温水浴箱:型号$ 6 5 8 ,浙江温州永强医疗器械厂。 8
22、 、普通冰箱:海尔公司产品。 9 、7 0 冰箱:美国F o r m a 公司产品。 l O 、电子分析天平:A E 2 6 0 D e l t aR a n g e 型,M e t t l e rT o l e d o 公司产品。 l l 、磁力搅拌器:M D l 0 型,湖北黄石医疗器械厂研究所产品。 1 2 、P H 计:P H S 2 5 数显P H 计,上海精密科学仪器有限公司产品。 1 3 、T 2 5 和T 7 5 细胞培养瓶:美国C o m i n g 公司产品。 1 4 、2 4 孔和9 6 孔细胞培养板:美国C o m i n g 公司产品。 1 5 、细胞冻存管:美国C
23、o m i n g 公司产品。 1 6 、0 2 2 t t m 一次性微孔滤膜滤器:美国P a l l 公司产品。 1 7 、血球计数板:上海求精生化试剂仪器有限公司产品。 1 8 、P C R 扩增仪:B i o m c t r aP e r s o n a lc y c l e r 公司产品。 1 9 、电泳仪:E P S6 0 1 型,a m c r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品。 2 0 、电泳槽、电转移槽:C e l lI I I 型,B i n R a d 公司产品。 2 l 、荧光显微镜:A X i o s k o p 型
24、,O P T O N 公司产品。 2 2 、D N A 成像仪:国产。 2 3 、微波炉:格兰仕微波炉电器公司产品。 ( 四) 主要试剂 l 、1 9 9 培养基:清大天一公司产品,批号0 5 1 1 0 4 。 2 、小牛血清( c S ) :杭州四季青公司产品,批号0 5 0 6 0 7 等。 3 、胰酶:美国D I F C O 公司产品。批号2 0 7 4 3 5 F G 。 4 、二甲基亚砜( D M S O ) ;美国S i g m a 公司产品,批号0 6 3 F 5 2 3 3 。 5 、秋水仙素粉:上海如吉生物科技发展有限公司产品,批号2 0 0 5 0 9 1 2 。 6 、
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