血浆-血清-体液蛋白质组学(完整版 ) .ppt
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1、血浆、血清、体液蛋白质组学 研究及其应用,1,柳满然 Ph.D,E-mail: mliu-,Tel: 6848-5184,蛋白组学基本知识,2,血浆、血清蛋白组学,唾液蛋白组学,尿液蛋白组学,脑、脊液蛋白组学,一、蛋白组学基本知识,3,4,蛋白质组(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质 蛋白质组学(proteomics) 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学,5,基本生物学问题 Post-translational modification Protein-protein interaction Genom
2、e-Transcriptome-Proteome 临床应用问题 Disease marker-diagnosis Drug target-therapy,Proteomics,6,蛋白质组研究的基本技术,分离,Gel-based,Liquid-based,HPLC,FFE,SCX, RP, SEC,鉴定,MS,MALDI-TOF-MS,ESI-MS,MS-MS,2D-HPLC,MALDI-TOF-TOF,MALDI-Q-TOF,ESI-MS-MS,LC-ESI-MS-MS,计算机 技术,7,IEF: isoelectric focusing (等电聚焦),2-DE:Two-dimensiona
3、l gel electrophoresis,第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离; 第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离, 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开,HPLC:High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法),DIGE:2-D difference Gel Electrophoresis,基本缩略词,iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定
4、量,8,质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。 离子源又分为: 电子轰击源 (Electron Ionization,EI) 化学电离源 (Chemical Ionization,CI) 场致电离源 (FI) 电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization,ESI) 等,MS是单级质谱,适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品,单级质谱会出现很多干扰峰,影响测定。,MS:Mass Spectroscopy (质谱),MS/MS是串联四级杆质谱,通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞,选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片,不符合 一定质量数的离子
5、被抛弃,这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。,基本缩略词,9,ESI-MS:Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy, 电喷雾质谱,MALDI-TOF-MS:Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱, 是一种新型的软电离生物质谱,LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱,MALDI-TOF-TOF:基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱,MALDI-Q-TOF:基质
6、辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱,基本缩略词,10,PMF: Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱), 是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的 肽片段的质量图谱,蛋白质组学研究中,质谱测序一般采用两种方式: 一种是利用串联质谱 (MS/MS) 测序; 另一种是利用源后衰变 (PSD:post-source decay) 技术测序,基本缩略词,IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相pH梯度等电聚焦),11,PMF常用软件,Mascot: ,Profound: Prowl
7、.rockefeller.edu,PepIdent: www.expasy.ch/tools,ProteinProspector: Prospector.ucsf.edu,PepSea: 195.41.108.38,12,常用串联质谱检索工具,SEQUEST: Field.scripps.edu/sequest,PepFrag: Prowl.rockefeller.edu,ProteinProspector: Prospector.ucsf.edu,Mascot: ,13,基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程,14,Provides a hard-copy record of separati
8、on Allows facile quantitation Separation of up to 3000 different proteins Highly reproducible Gives info on Mw, pI and post-trans modifications Inexpensive,Limited pI range (4-8) Proteins 150 kD not seen in 2D gels Difficult to see membrane proteins (30% of all proteins) Only detects high abundance
9、proteins (top 30% typically) Time consuming 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7,2DE:Advantages & Disadvantages,15,传统的基于2DE的差异蛋白质组学分析技术,优点:,技术路线成熟,重现性和直观性好,费用较低,展示差异蛋白质的PI和Mw,缺点:,蛋白质共迁移(comigration)问题,不适合于很复杂的样品,线性动态范围较窄,强疏水性,强硷性,分子量过大(150kD)的 蛋白质受到限制,16,基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程,iTRAQ-LC-MS/
10、MS,17,18,Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method Generally high throughput Protein identification and quantification is straightforward process is simple Can be used to ID post-trans. modifications,Requires more handling for sample isotopic labeling Low reproducibility Requires high level e
11、xpertise Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteins,Advantages Disadvantages,Shotgun:Advantages & Disadvantages,19,Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods,20,IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相pH梯度等电聚焦),建立于20世纪80年代,一种新型等
12、电聚焦技术。利用一系列具有弱酸 或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定,在滴定终点形成pH梯度并参与 丙烯酰胺的共价聚合。,优点:与传统两性电解质等电聚焦相比,具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法,可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备,特点:形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度,21,使用宽pH范围的胶条(pH 3-10)可以在同一块凝胶上看到样品中绝大多数的蛋白质。 将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用,也同样可以得到整个pH 3-10范围的结果。 因为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域,所以研究人员有时选用非线性梯度的胶条
13、,这种胶条将两端的pH梯度压得很窄,却可以使中间区域的蛋白质得到较好的分离。 将窄pH梯度的线性IPG胶条重叠使用,效果要比用非线性胶条好得多,它可以检测出样品中更多的蛋白质斑点。,pH 梯度范围的选择,22,常用蛋白酶抑制剂,23,优点: 样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上,能直观可靠确定; 对isoform 的定量较准确; 比传统2DE动态范围有所增加. 缺点: 标记效率低只Lys的氨基的1%左右; 受限于2DE的分离能力; 受蛋白质在2DE上共迁移现象的影响,可能对复杂样品的isoform定量产生影响.,2-D Difference Gel Electrophoresis (DIG
14、E),24,Cys-labeling Modify before digest High probability of losing PTM,缺点: 只标记Cys,没有Cys的蛋白质得不到鉴定。纯化含Cys肽段时,有效肽段损 失巨大(达90%)。ICAT 分子量大,对于较小肽段影响数据库的搜索。2H, 1H 标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时间不 一致现象,使得定量困难.,ICAT Workflow (技术流程) 补充,优点: 克服了2DE方法相应的缺点。 只鉴定含cys的肽段,减少了质谱分析的复杂程度。,25,Isobaric labeling: N-term + Lys Modify
15、 after digest Requires MS/MS measurements,优点: 全标记,范围广,灵敏度高于ICAT。 可以做绝对定量。,缺点: 需要MS/MS分折后才能定量; 酶解后标记样品复杂程 度高; 只适合LC-MALDI-TOF/TOF或LC-MS/MS。,iTRAQ Workflow (技术流程) 补充,26,The mass difference between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.0419 Da for each modified amino group: Lys
16、+ Protein N-term. Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue,优点: 蛋白水平标记,全标记NH2,范围广,灵敏度高,有利于兼容其它蛋白 质的分离分法如2DE,SDS-PAGE等。所有的质谱都可以分析,包括离子阱。 缺点:需要用除Trypsin 以外的酶切,以提高蛋白质的鉴定率和定量率。,ICPL Workflow (技术流程) 补充,ICPL Reagent Structure,27,Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI) 补充,优点:移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小,提高了质谱分析中的效率和 降低了数据库搜索的复杂性。
17、标记在C上使得共流出时间一致。 缺点:同ICAT试剂差不多。,28,SILAC Workflow (技术流程) 补充 (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture),优点: 省去了体外标记化学反应和分离纯化步骤, 有利于低丰度蛋白质的检测定量。 完全兼容任何传统的蛋白分离手段。,缺点: 不能对组织样品进行分析定量。 培养细胞在富含稳定同位素介质中生长, 可能会影响细胞的繁殖,由此改变蛋白质的 表达水平。 昂贵。不适用于人体样品。,29,Enzymatic labeling: trypsin catalyzed O16 to
18、O18 exchange 补充,优点: 方便对MS/MS扫描时Y系列离子的识别。 简单,快速。 完全标记,不带倾向性。 不会丢失翻译后修饰信息。,缺点: 不稳定。 完全标记后肽段只相差4Da。,30,Label-free strategies:Extracted ion current (XIC)-based quantification 补充,优点: 可准确定量。 不需标记,可对任何样品进行定量。 不丢失任何修饰信息。,缺点: 在样品定量分析时,容易出错。 需做平行的两次实验,对仪器,环境等要求高。 不适合时,两个独立的样品进行多次纯化。,31,Peptide ions from more
19、abundant proteins would be selected more frequently in MS spectrum.,LC-MS/MS,Spectral counts OR number of peptides identified for each protein,根据spectral counts 的数目直接估计丰度或根据公式计算出一个丰度值,例子: emPAI =10PAI-1,where PAI is the number of observed peptides divided by the number of theoretically observable pe
20、ptides. M.Mann et al MCP 4.9 1265-1272,Semiquantification: Spectral counts 补充,优点: 简单,直接,多用于单个复杂样本内蛋白质之间的相对定量.,缺点: 尚无报道用于两个样本之间蛋白质的定量;不同样本、不同LC-MS/MS之间的比较不太准确.,二、血浆/血清蛋白组学,32,(Human Plasma Proteome Project,HUPO PPP),33,HUPO PPP,2001.10. 国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO),在美国成立。启动人类蛋白质组计划(H
21、umanProteome Project, HPP).,HPP的主要研究目的: 鉴定人类基因组编码的全部蛋白质及其功能; 揭示: 构成各种人类组织不同细胞类型的蛋白质表达谱; 蛋白质组翻译后修饰谱; 蛋白质组亚细胞定位图; 蛋白质-蛋白质相互作用关系图; 蛋白质结构与功能联系图,34,HPP首批执行计划: 人血浆蛋白质组计划 (Human Plasma Proteome Project,HUPO PPP) 人肝脏蛋白质组计划 (Human Liver Proteome Project,HLPP ),HUPO PPP由美国科学家Gilbert Omenn牵头 十多个国家/地区、57个实验室参与,
22、HUPO PPP,35,HUPOPPP的先期(pilot phase)目标: 比较不同样本收集、处理和储存过程对蛋白质分析的影响; 通过分析血浆蛋白质组,比较不同蛋白质组分析技术平台的 敏感性和局限性; 比较不同高丰度蛋白去除(depletion)方法,以及去除与否 对蛋白鉴定的影响; 数据提取、整理和储存的标准化,目的: 全面认识人类正常血浆/血清中的全部表达蛋白 全部表达蛋白在不同生理条件下的变异度,HUPO PPP,36,人血浆/血清蛋白质组学研究的特别意义,Gilbert Omenn,2006.12 人血浆蛋白质学的专著,37,人血浆/血清蛋白质组学研究的独特地位,人血液中蛋白质的来源
23、几乎与所有细胞、组织、器官有关 人血液中蛋白质可以直接反映机体的病理、生理状态。即机体中的 每一个细胞都可能将反映其生理状态的记录,以排泄物或信号分子的 形式释放到血液中 人血液中蛋白质是发现各种疾病相关的已知和/或未知生物标志物的 最有价值的标本,常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分; 在疾病的早期诊断方面,迫切需要发现更有效的疾病标志物, 但迄今为止,公认的新的疾病标志物的数量极少。,38,人血浆蛋白质总况,血浆大约含有7%的蛋白质,1%的其它物质,92%的水分。 这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质,各种病理、 生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质,血浆蛋白质
24、总数估计在10,000种甚至更多,所含蛋白总量达到60-80mg/ml。血浆中总蛋白量的99% 由为数不多的22种高丰度蛋白所占有,血浆中蛋白质浓度在一个高动态范围内(912个数量级)变动 从3550 mg/ml的血清白蛋白,到110 pg/ml或更低的趋化因子,39,人血浆蛋白质组的组成,a. 组成性蛋白 主要指肝脏和小肠的分泌蛋白,它们在血浆中发挥作用, 如白蛋白,纤维蛋白原等 b. 免疫球蛋白 血浆中大约含有数百万种抗体,血浆蛋白根据其来源和功能可分为:高丰度蛋白和低丰度蛋白,高丰度蛋白:,40,低高丰度蛋白,c. 组织渗漏蛋白:组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、 死亡而进入血液的
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