ELISA灰区的设置及质控方法.pdf
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1、ELISA 灰区的设置及质控方法 ELISA测定的阳性判断值,通常是将大量阴性和阳性人群的测定数据进行统计分析后确定 的,其确定依据为判断结果的假阳性和假阴性率最低。在阳性判断值周围一定范围内之外的 测定结果可归为可疑,亦即ELISA 测定的 “ 灰区 ” 。“ 灰区 ” 的大小可用统计学方法确定。测定 结果处于 “ 灰区 ” 的样本,可通过确认试验或追踪检测来确定到底是阳性还是阴性。” 。“ 灰区 ” 的大小可用统计学方法确定? 具体是怎么确定的,。 或者大概粗略的方法计算是怎么样的呢?高手在哪呢ELISA“灰区 ” 是把定量分析的正常 值范围引入定性分析而建立的概念。 灰区的设置有二种:
2、(1)C.O(1 C),C 为该试剂的批内C (一般在 15-20% 间); (2)C.O2S,S 为实验室做室内质控ROC 的 S。 另外,个人认为:ELISA“灰区 ” 对于不同项目和应用的领域不同,其设置不能一概而论。根据 美国疾病控制中心(CDC )对美国Ortho 的抗 HC 检测的 ELISA 试剂盒进行研究,发现只 有检验结果S/CO 3.8 时,高度预示HC 抗体真阳性状态;若检验结果S/CO0.5是阳性,如果测量得吸光度是0.4 的话怎么判 断,结果是阴性,但是是有很明显颜色的。在血站系统这样的血就不敢用,怎么解决呢,我 们经常遇到测量阴性但是有颜色的标本,用不同厂家的试剂或
3、是同种试剂重复实验还是一 样,又担心存在弱抗体的问题。 怎么解决呢,万分感激国内试剂测HBSAG 的 cutoff 值一般不会达到0.5 ,除非不做空白。 其 cutoff 的公式一般为NC*2.1 。我只是举例。别找问题以外的事情来说呀,我等答案等得 着急第三章ELISA 技术的质量控制 概述 Engall和Perlmann于1971年 首 先 建 立 了 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 ( enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。随着科技的发展,ELISA 在抗原、抗体、酶、固相载体及 包被技术等方面都有较大的进步,其灵敏度和特异性均大大提高。由于
4、该技术具有简便、快 速、经济等特点,因而已被广泛应用于各行业。尽管如此,ELISA在应用过程中仍然存在 着许多难点,必须严格控制才能保证检测的质量。 ELISA 质量保证是一个复杂的过程,许多重要的环节都影响到检测的质量。现分述如下: 一、方法学的影响 ELISA 测定模式包括以下几种:双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM 抗体捕捉法、 竞争抑制法, 其中竞争抑制法因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响,结果重复性 较差,质量较难控制。 二、试剂因素 1.试剂的选择 免疫检测的原理均基于抗原抗体反应。由于该反应过程受多种因素的影响,如普遍存在基质 效应、 交叉反应等, 因而检测结果难
5、以溯源,不同方法、 不同试剂之间甚至同一试剂不同批 号间结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程度上决定了检测的水平,因此在引入新项目之前 必须对试剂进行严格的评估。试剂的评估有以下几个步骤:确定开展该项目的必要性; 了解该项目现有的检测方法和原理;在了解试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较, 判断标准首选参考方法或参考物质,其次为临床的满意度及权威机构的报告如各级室间质量 评价、 CDC 报告等;定期对检测结果进行追踪反馈直至最终认可该试剂。 2.试剂的准备 不同批次的ELISA 试剂在制作过程中很难保证质量完全一致,即使是通过批批检的项目其 检测结果也存在差异,因此必须选择和订购长批号的试剂,
6、并保证保存条件。严格执行这一 标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程,并且能够保 证结果的稳定性;对于效期短、使用率低的试剂,应当小量分装, 每次使用则取分装部分即 可,避免反复冻融造成试剂的失效。 试剂使用前必须平衡至室温,否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需使用的 试剂应密封并及时放回冰箱保存。 三、样本因素 标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素,前者包括类风湿因子、补体、 异嗜性 抗体、自身抗体、溶菌酶等,后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标 本凝固不全、 冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以
7、避免也 是必须避免的因素,而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒。在临床中遇到 少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。以下对外源性干扰因素进行简要说 明: 1.标本溶血要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团,其具有类过氧化物的 活性,因此,在以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)为标记酶的ELISA 测 定中, 如果血清标本中血红蛋白浓度较高,则其就很容易在温育过程中吸附于固相,从而与 后面加入的底物反应显色。 2.标本被细菌污染标本的采集及血清分离要注意尽量避免细菌污染。细菌菌体中除可能含 有内源酶对测定产生非特异性干扰外,还可
8、能对抗原抗体等蛋白产生分解作用。另外标本在 保存中出现浑浊或絮状物时,应离心沉淀后取上清检测。 3.标本贮存时间过长标本在低温下保存时间过长,IgG 可聚合成多聚体,在间接法ELISA 测定中会导致本底加深、甚至出现假阳性结果。通常情况下血清标本可在2 8下保存l 周,冷冻保存时间会更长,但对于抗体或抗原含量低的标本而言,则可能会因抗体掉价、抗 原分解而出现假阴性结果。 4.标本凝固不全血液通常在采集后半小时后开始凝固,18 24h 完全凝固。如果在血液未 凝固时即离心分离血清,则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。为了缩短 标本处理时间, 可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者
9、采用带分离胶的采血管或于采 血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。 5.冷冻保存标本避免反复冻融标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白 等分子产生破坏作用,使抗体效价跌落从而引起假阴性结果,所以测抗体的血清标本如需保 存作多次检测,宜少量分装冻存。此外,标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩,分布不均,因 此重新融解的标本必须混匀,但不要进行剧烈振荡,反复颠倒即可。 四、操作因素对ELISA 结果的影响 ELISA测定一般遵循以下步骤:固相包被 加样品 温育 洗涤 加酶结合物 温育 洗 涤 加底物 温育 显色 终止显色 比色 目前各种形式的ELISA 自动分析仪已经进入市场,如广泛应用
10、于血站系统的微板式全自动 酶免分析仪,其试剂为开放式的,而对于其它类型的仪器,则试剂和仪器往往是配套的。但 当前大部分医学实验室均采用手工操作加仪器测定的方式。ELISA操作步骤复杂,操作不 当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。 1.加样 加样器是一种比较精密的工具,其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原 因造成加样不准, 尤其是对于样本量较大的临床实验室,因此必须定期对加液器进行维护和 校准。 每次加不同的标本时均需更换吸嘴,以免发生交叉污染。加样时速度不可太快,避免 将标本加在孔壁上部,并注意不要溅出或产生气泡。加样时还应当注意操作时差对结果的 影响, 操作时差
11、是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。操作时差在每个实验中都存在,尤 其是手工操作, 日常检测标本多达几百个,从加入第一个标本到最后一个标本,需几十分钟, 加入试剂及混匀等均存在着前后的时间差异,使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致,操作 时差对竞争法检测的结果影响更大,在加酶结合物和底物时可用定量多道加液器,使加液过 程迅速完成。 如果使用滴瓶除注意滴加的角度外还要注意滴加的速度,速度太快, 容易出现 重复滴加或者加在两孔之间,造成非特异性吸附。另外有些项目在检测前需要稀释以减低非 特异性反应, 但稀释的方式非常重要,如果采用手工稀释则容易因操作者个体差异而产生不 一致的结果,尤其是吸光度处于临
12、界值附近的标本,因此最佳的方式是采用振荡器混匀。 2.温育 在 ELISA 检测中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完 成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation) 。 温育常采用的温度有43、 37、室温和4(冰箱温度)等。37是实验室中常用的温 育温度, 也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。有实验表明, 抗原抗体反应一般在37 经 1 2 小时产物的生成可达顶峰。为加速反应,可在一定范围内提高反应的温度并在反应 过程中连续振荡以增加抗原抗体接触的机会。抗原抗体反应在4反应更为彻底,形成的产 物更多更稳定,但因所需时间太长,在ELISA
13、 检测中一般不予采用。 温育的方式有温箱法、微波辐射法、 水浴法等, 其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的 周围孔与中央孔结果的吸光度差异(这种现象被称为“ 边缘效应 ” )。若用温箱温育则ELISA 板应放在湿盒内, 湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿的纱布, 最后将 ELISA 板放在湿纱布上。 采用这种温育方式的关键是必须保证湿盒内的温度达到反应的要求,可在 反应前将湿盒预温至规定的温度,并用温度计监测反应过程。采用水浴时,将ELISA 板置 于水浴箱中,板底贴着水面。为避免蒸发,板上应加盖或用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔, 此时可让反应板漂浮在水面上。温育过程中, 反应板不
14、宜叠放,以保证各板的温度都能迅速 平衡。严谨的ELISA 试剂盒一般都规定了明确的温育温度,若要求室温温育,则一般是指 2025。微波辐射法能缩短温育时间,但不能解决“ 边缘效应 ” ,因而较少使用。 3.洗涤 洗涤是 ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤。其目的是去除反应体系中与反应 无关的成分、 未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。由于 抗原和抗体的包被通常是在碱性条件下与固相的疏水键相互作用而被动吸附于其上的,因此 必须注意非离子去垢剂的使用浓度,最常用的洗涤液是含0.05 吐温 20 的 0.02mol/L , pH 为 7.4 的 PBS 液,如
15、果洗涤液中的吐温20 超过0.2,可使包被于固相上的抗原或抗体 解吸附而影响实验的测定下限。 洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式,手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗 板方式如何, 在向板孔内注液时应当避免气泡残留孔内,否则会因洗涤液难以进入孔中而影 响洗涤效果。 在采用洗板机洗板时,一定要将板条平放于板架上,保证洗板机上的每个吸液 针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净,否则空白值将升高甚至出现“ 花板 ” 现象(背景 不干净) , 造成实验失败, 尤其是当酶结合物非特异吸附而残留于板孔时。若采用手工洗板, 则可在每次弃去板孔内液体后将反应板于布料上拍干,布料可在消毒洗涤后重复使用。
16、 手工洗板一般为35 次,使用洗板机洗板时,其所需次数可通过以下实验确定:选择 8 12 HBsAg ELISA包被板条,在每孔中平行加入相同的一份弱阳性血清,按试剂盒说明加入酶 结合物并完成温育,洗板机设置如下:第1 次洗涤 1 排、第 2 次洗涤 2 排、第 3 次洗涤 3 排 直至 8 次洗涤 8 排,每次只洗涤1 遍,其结果是第1 排洗涤了8 遍,第 2 排洗涤 7 遍 第 8 排洗涤1 遍,加底物显色后,根据吸光度值不再改变的反应条的洗涤次数来确 定最佳的洗板次数,例如第 3 排反应条吸光度值不再改变,则认为该项目最佳洗涤条件为6 遍。另外有三方面必须注意:一是在使用洗板机洗板时,通
17、常在上机前应先将反应液弃去并 用流水快速冲洗1 遍,避免因反应液对洗板机管道污染而造成的交叉污染和背景颜色加深, 但对于粘性大的稀释液或反应液而言,则需直接上机洗涤,并增加洗板后清水冲洗管路的次 数;二是对于两步法而言第一步洗涤次数不宜太多,否则将降低结果的吸光度值。 4.显色 显色是ELISA 中的最后一步温育反应,在以HRP 作为标记酶的ELISA 试剂盒中,主要采 用 TMB 和 OPD 两种底物,其中以TMB 最为多见, TMB 底物显色一般要求室温或37反 应 1530 分钟。研究表明,显色受时间和温度的影响,一般37反应 30 分钟可使显色充 分,如果缩短反应时间或者降低反应温度均
18、可影响检测的下限。为了保证结果的稳定性,必 须固定显色时间和温度,但不少操作者往往忽略了这一点。TMB 显色体系的A 液和 B 液可 在使用前先混合然后用排枪加入反应孔中,这样既节省人力又缩短了操作时差对结果的影 响。反应液应新鲜配制并且避免接触金属器皿,否则可因氧化等原因产生颜色反应。OPD 由于其具有致癌性目前已很少使用。 5.比色 ELISA显色的结果必须通过酶标仪进行检测,有两个重要的原因:一是不同的个体的色觉 存在差异,如果仅凭肉眼判断,则结果重复性差,并且难以形成统一的判断标准,尤其是对 于 HBeAb 、 HBcAb这样的检测项目;二是日益频繁的医疗纠纷要求临床实验室必须对 EL
19、ISA检测的原始吸光度值,阴阳性判断结果等原始数据进行保存,否则面对医疗纠纷时 将无法举证。 TMB 的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS )等酶抑制剂均可使反应终止,各 类酸性终止液则将蓝色转变成黄色。有实验表明,从终止反应后2 分钟开始,样本的吸光 度值逐渐下降, 起始吸光度值越高其下降速度越快,为保证实验结果的稳定性,宜在终止反 应后 2 分钟内读取吸光度值。 酶标仪应采用双波长进行测定,必须包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸收峰波长,在非 敏感波长处测定特异性显色的吸光度值接近为零,此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、 背景等造成的光干扰。以TMB底物为例,其最大吸收的波长
20、为450nm ,非敏感波长为 630nm ,双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰,一 般不设空白孔,否则会出现吸光度值为负值的现象。 酶标仪的使用需强调仪器的维护和保养,酶标仪首先应放置通风处,避免机器内部尤其是滤 光片发霉, 在使用过程中避免酸等物质溢出腐蚀仪器,每半年或一年请计量局对酶标仪进行 检定, 并请厂商定期维护。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体。酶标仪在使用 前应先预热15 30 分钟,测读结果会更稳定。 五、灰区的设置 通常情况下, ELISA 定性实验以 “ 阳性 ” 和 “ 阴性 ” 来报告结果,两者间有一条分界线被称为“ 阳 性判断值
21、 ” (cut-off alue , CO 值),这是定性免疫测定结果报告的依据。由于ELISA CO 值的设置不能区分所有正常和异常的人群,尤其是位于CO 值附近的人群,并且ELISA 检 测具有以下几个特点:检测变异大(18% 65% );不同试剂盒CO 值存在差异;病毒感染 存在窗口期; 病毒变异后表达产物含量低以及个体差异等,因此在 CO 值附近存在一个临床 意义可疑的的区域被称之为“ 灰区 ” , 在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的ELISA 试剂盒 中均未涉及 “ 灰区 ” 的设置,但仅仅依靠CO 值来决定感染的有无,尤其是对献血员的筛查具 有较大的风险。 因此对于检测结果位于“
22、 灰区 ” 的病人可采用确认实验或追踪检测的办法加以 确诊。 目前 “ 灰区 ” 的设置有二种方式:CO ( 1 C),C 为该试剂的批内C ( 一般在 15-20%) ; CO 2s,s 为实验室做室内质控ROC (常规条件下的变异)的标准差。 六、标本复查 ELISA手工检测过程复杂,影响因素较多,即使室内质控在控,也可能因孔间差异而造成 结果的差异,因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法,比如对HBsAg 、HBeAg 、 HC-Ab 、HI-Ab 、TP-Ab 等项目的可疑、弱阳性标本及少见模式的检测结果进行复查。 复查方式主要有两种:一是采用同一种试剂复查,理由是市售试剂均通过国
23、家食品药品监督 管理局( SFDA )认可,严格按照其说明书操作,检测结果具有法律效应,若使用不同的试 剂 (非确证试验) 复查,当结果不相符合时,则最终结果难以判断(免疫检测缺乏“ 金标准 ” )。 另一种复查方式是采用国外进口试剂进行复查,其理由是尽管进口试剂并不是“ 金标准 ” ,但 实验室已经对此高度重视,并且使用了质量较好,价格较贵的试剂,但该法对于小医院而言 则很难实施。 七、结果判断和报告 常用下列几种方法表示结果: 1.定性测定 (1)阳性判定值法 (cut-off alue ,CO) :一般为阴性对照的平均A 值加一个常数,试剂制备、 检测过程必须严格标准化,要先计算出阳性对
24、照A 值平均数和阴性对照A 值平均数。标本 A 值 阳性判定值为阳性。阳性判定值公式中的常数是在特定的检测系统中通过对大量标本 的实验检测而得到的。现以HI 检测试剂盒为例。NC= 阴性质控对照的A 值; PC1= 抗-HI-1 阳性质控对照的A 值; PC2= 抗-HI-2 阳性质控对照的A 值; NC 值的要求: NC 必须小于 0.250 。 去掉大于等于0.250 的阴性质控对照。 计算留下的阴性质控对照的平均值(NCx ) 。 NC 必须在 0.6NCx 和 1.4NCx 之间。去掉 NC 小于 0.6NCx 和大于 1.4NCx 的阴性质控对 照。实验满足下列条件有效:多于半数的阴
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