realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点.pdf
《realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点.pdf(20页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、real-time PCR技术的原理及应用 摘要:一、实时荧光定量PCR 原理 (一)定义:在PCR 反应体系中 加入荧光基团, 利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程,最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 (二)实时原理 1 、常 规 PCR 技术: 对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法 对起始模板准 一、实时荧光定量PCR 原理 (一)定义:在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累 积实时监测整个PCR 进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。 (二)实时原理 1、常规 PCR 技术: 对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无
2、法对起始模板 准确定量,无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量 PCR 技术: 利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化,通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量? 通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念: (1)扩增曲线: (2) 荧光阈值: (3)Ct 值: CT值的重现性: 5、定量原理: 理想的 PCR 反应: X=X0*2 n 非理想的 PCR 反应: X=X 0 (1+Ex) n n:扩增反应的循环次数 X:第 n 次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量
3、 1)确定未知样品的 C(t) 值 2)通过标准曲线由未知样品的C(t) 值推算出其初始量 7、DNA 的荧光标记: 二、实时荧光定量PCR 的几种方法介绍 方法一: SYBR Green法 (一)工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链 DNA 的小沟部位 2 、SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光 3、变性时, DNA 双链分开,无荧光 4、复性和延伸时,形成双链DNA , SYBR Green 发荧光,在此阶 段采集荧光信号。 PCR 反应体系的建立及优化: 1 、SYBR Green 使用浓度 : 太高抑制 Taq酶活性,太低,荧光信 号太弱,不易检测 2、
4、Primer :引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准 3、MgCl2的浓度 : 可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应 Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数 : 由酶和引物决定 6 、其他与常规 PCR 相同 (二)应用范围 1、起始模板的测定; 2、 基因型的分析; 3、 融解曲线分析: 可以优化 PCR 反应的条件, 对常规 PCR 有指 导意义,如对 primer 的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变 异产物、多种产物。 (三)优点及缺点 优点:对 DNA 模板没有选择性;适用于任何DNA ; 使用方便;不 必设计复杂探针;非常灵敏;便宜。 缺点:容易与
5、非特异性双链DNA 结合,产生假阳性; 但可以通过 融解曲线的分析,优化反应条件;对引物特异性要求较高。 方法二: TaqMan- 水解型杂交探针 *5 端标记有报告基团 (Reporter, R) ,如 FAM 、VIC 等 *3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) * 探针完整, R所发射的荧光能量被Q基团吸收,无荧光, R 与 Q分开,发荧光 *Taq 酶有 5 3外切核酸酶活性,可水解探针 (一)工作原理 注意:每扩增一条 DNA 分子,释放一个荧光信号, 可以在循环过程中 任一点检测荧光 PCR 反应的建立: 1、引物、探针的设计: 探针 Tm为68-70 ,30 bp
6、, 5 不能有 G ,G可能会淬灭荧光 素, 引物尽量靠近探针,扩增片段400 bp,引物 Tm为59-60 2、反应参数的确定: 一般为: 94 ,10-20S 60 ,30-60S(Taq酶53外切核酸酶活性在 60 最高) 也可通过温度梯度优化退火温度72 ,45 S, 3、优化引物和探针浓度: 获得最小 Ct 值,信号/ 背景比值的最大 值 引物浓度: 50-900nM 探针浓度: 50-250nM 4、其他与常规 PCR 相同 (二)优缺点 优点: 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补 重复性比较好 缺点: 只适合一个特定的目标; 委托公司标记
7、,价格较高; 不易找到本底低的探针 Real-time PCR 与 RT-PCR 比较 2009-08-20 16:50:02 来源: 未知 【大 中 小】 评论: 条 摘要: Real-time PCR 与 RT-PCR 是两种不同的 PCR 方法,适用范围 也不同。 Real-time PCR中文译作实时聚合酶链反应,是一种最新 发展的定量 PCR 技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR 产物,一方 面提高了灵敏度,另一方面还可以做到PCR 每循环一次就收集一个数 据,建立实时扩 Real-time PCR 与 RT-PCR 是两种不同的 PCR 方法,适用范围也不 同。 Real-tim
8、e PCR 中文译作“实时聚合酶链反应” ,是一种最新发展 的定量 PCR 技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR 产物,一方面提 高了灵敏度,另一方面还可以做到PCR 每循环一次就收集一个数据, 建立实时扩增曲线,准确地确定CT值,从而根据 CT值确定起始 DNA 拷贝数,做到了真正意义上的DNA 定量,较以往常用的终点定量的方 法更加准确。根据所使用的技术不同,荧光定量PCR 又可以分为 TaqMan探针和 SYBR Green I 荧光染料两种方法。 Real-time PCR 所 采用的专用 PCR 仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧 光强度进行检测, 实时的记录荧光强度的改
9、变, 从而对样品的浓度进 行精确的定量。 RT-PCR 是 Reverse transcription PCR的简称,中文译作“逆转 录聚合酶链反应”,是将 RNA 的反转录(RT )和 cDNA的聚合酶链式扩 增(PCR )相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA 合成 cDNA , 再以 cDNA为模板,扩增合成目的片段。 RT-PCR 技术灵敏而且用途广 泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中 RNA 病毒的含量和直接 克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA 可以是总 RNA 、mRNA 或 体外转录的 RNA 产物。无论使用何种RNA ,关键是确保 RNA 中无 RNA 酶和
10、基因组 DNA 的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择 随机引物、 Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有 发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。 但二者的基本原理是相同的,即PCR 技术。 RT-PCR 原理与实验技术 2009-08-20 16:25:05 来源: 未知 【大 中 小】 评论: 条 摘要:一、知识背景: 1 、基因表达: DNA RNA Protein 单拷贝基因 表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白 mRNA(每个 mRNA 存活4d,可以合成 105个丝心蛋白)共合成109个丝 心蛋白 。 因此单拷贝基因的mRNA
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- realtimePCR RT PCR 详解 及其 区别 要点
链接地址:https://www.31doc.com/p-5197998.html