(完整word版)GST_pull_down试验方法(自己总结)(2),推荐文档.doc
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1、12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达(1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。(2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中,37摇菌过夜,获得种子液。(3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中,使起始OD600为0.1。(4) 28,220rpm摇菌培养2小时。(5) 加入50l 100mM IPTG,1627摇菌培养18小时。(6) 收菌,将菌液倒入大离心管,2管/50ml菌液,4 5krpmx5min离心,弃上清。(7) 加入10ml PBS/管,重悬细胞,5krpm离心5min,弃上清。(8) 加入2mlPBS/管,
2、重悬细胞。转移至5ml离心管。(9) 超声破壁破壁前,在细胞悬液中加20l 10mg/ml PMSF,80l蛋白酶抑制剂(100x)。破壁参数:Frequency:100200w60s, pause20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加100l 20%TritonX100,冰上放置30min。(10) 将裂解液分入1.5ml离心管中,4离心12krpm10min,取上清。(11) 吸取少量上清,加入蛋白电泳上样缓冲液,在沸水中煮3min。离心(12krpm,1min),取上清作SDS-PAGE电泳,检测表达情况。12.2 准备50%GST Sepharose 4Bsl
3、urry(1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。(2) 取677l原液/管,3krpm离心5min,弃上清。(3) 加500lPBS,颠倒混匀,3krpm离心5min,弃上清。反复5次。(4) 加500lPBS,颠倒混匀,配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。12.3 GST融合蛋白的纯化(1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20l 50%Glutathione Sepharose 4B,4,摇床上摇,反应30min60min。(2) 3krpm离心5min,弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白,(如
4、果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高,可以只接合一次,如果要结合更多则接着往下做)(3) 在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清,4,反应30min60min。3krpm离心5min,弃上清。重复该步骤多次,就可以使Sepahrose上结合610ml 裂解液中的GST融合蛋白。(4) 在管中加入预冷的200lPBS(沿壁加入,小心勿剧烈,以免打断珠子与蛋白的联接),轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤一次, 3krpm离心3min,弃上清。(5) 反复三次(最后一次以小枪吸净珠子表面水膜,其余几次可以中枪吸,尽量吸净但不吸走珠子),即获得结合有GST融合蛋白的Sephar
5、ose。(6) 如果用于检测,在Sepharose加入1520l 1蛋白电泳上样缓冲液,在沸水浴中煮3min。12krpm离心1min,取上清作SDS-PAGE电泳。(7) 如果用于pulldown测试,参见pulldown 步骤。14.体外蛋白质结合分析(GST-pull down)(1) 将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮在500lNETN缓冲液中加入2030l含有其他蛋白的溶液,例如pET发酵的产物,细胞表达的产物等,同时采用结合有GST空蛋白的Glutathione Sepharose 4B平行操作作为对照。(2) 在水平摇床上,4晃动48小时
6、。(3) 离心(3.6krpm,2min)。吸去上清,注意不要扰动底层的Sepharose.(4) 加入200l缓冲液H对Sepharose进行洗涤。注意加入缓冲液H时要贴壁加,不要直接冲击Sepharose,随后轻柔晃动,使Sepharose重悬即可。(5) 低速离心(3krpm,2min)吸去上清,注意不要扰动底层的Sepharose。(6) 重复步骤的洗涤23次。(7) 吸干Sepharose上方的水层后,加入2030l 1蛋白电泳上样缓冲液,沸水浴4min,冻存于20。(8) 做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。GST 试验流程(梗概):(1) Glutathione 琼
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