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1、. . (1)荧光素类 Fluorescein 标准荧光素( Reference standard)之一 , 在其基础上进行结构改造, 可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于 Argon-ion Laser的 488nm光谱线,有相对高的荧光吸收,较好的荧光产率以及 良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样,Fluorescein具有光淬灭率高,pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列(Confocal laser scanning microscopy)和流式细胞计应用(Flow cytometry )。 FITC 异硫
2、氰酸荧光素,Fluorescein isothiocyanate,是荧光素衍生物的一种,5-FITC 较 6-FITC 更经常 使用。 FITC 的异硫氰酸基能与氨基反应,可用于标记氨基修饰DNA ,一旦形成,产物极为稳定。适用于 Argon-ion Laser的 488nm光谱线, Abs/Em=492/519nm(pH=9.0)。与蛋白的结合力也强。 FITC 具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏,不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针;FITC- 多肽用于 Edman降解蛋白测序; FITC 也经常被用于蛋白电泳检 测(即使是毛细管电泳)和荧光能量激发转移测试。 FA
3、M 羧基荧光素, Carboxyfluorescein,是荧光素衍生物的一种,5-FAM较 6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester,即 5-FAM (NHS )广泛存在于荧光标记试剂盒。 与 FITC 相比, FAM与氨基反应更快,产物也更稳定,但FITC 结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于 Argon-ion Laser的 488nm光谱线, Abs/Em=492/518nm(pH=9.0),具有荧光素衍生物 的普遍特性,在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中,标记其中的d/ddCTP(PE公司),也经常
4、用于PCR 产物定量,核 酸探针等。 TET 四氯荧光素, Tetrachloro fluorescein,是荧光素衍生物的一种。 TET以及 HEX均是在 FAM基础上加以改进的,氯原子使FAM的 Abs与 Em值都产生一定的红移,并在一 定程度上减弱了pH 敏感性。 TET也适用于Argon-ion Laser激发光源, Abs/Em=521/536nm 。 TET, HEX , FAM和 TAMRA 可配合用于DNA自动测序中,其中 TET用于标记 d/ddATP, HEX用于标记 d/ddGTP 或 d/ddATP(PE公司) HEX 六氯荧光素, Hexachloro fluores
5、cein,是荧光素衍生物的一种。 . . 适用于 Argon-ion Laser激发光源, Abs/Em=535/556nm。(请参见TET介绍) JOE 羧基 -4,5-二氯 -2,7-二甲氧基荧光素, Carboxy-4,5-dichloro-2,7-dimethoxyfluorescein, 是荧光素衍生物的一种,6-JOE 更被广泛使用。 JOE荧光产量高, pH敏感性弱,适合于标记蛋白。6-JOE 也适合于 Argon-ion Laser激发光源, Abs/Em=520/548(pH=9.0) 常用于 DNA自动测序,标记d/ddATP,也经常被用于进行电泳检测与PCR 产物定量。
6、(2)罗丹明类( Rhodamine dye ) R 110 标准荧光素( Reference standard )之一 , 在其基础上进行结构改造, 即可产生一系列罗丹明类衍生物。 与 Fluorescein类衍生物相比,罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性,更高的荧光产量以及更低的pH 敏感性 罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸,但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭,故大多 数不适宜用于标记蛋白。 R110被用于 DNA自动测序。 TAMRA 全称羧基四甲基罗丹明,即Carboxytetramethylrhodamine,是罗丹明类荧光素衍生物,6- TAMRA被 广泛使用。 TAMR
7、A 是少数几个能用于标记蛋白的,6- TAMRA 适用于 Argon-ion Laser 激发光源, Abs/Em=547/573nm (Ph=8.0), 6-TAMRA (NHS )常用于荧光标记试剂盒中。 6- TAMRA主要用于 DNA自动测序中。 Texas Red Texas Red 是一个长波长荧光素, 与 Fluorescein几乎没有波谱重叠,只适合于Ar-Kr Laser的 568nm 光谱线或 He-Ne Laser 的 594 光谱线 ,比 Tetramethylrhodamine和 LissamineTM Rhodamine B波长更长, 荧光量更高。 Texas Re
8、d 在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Third labels)。 (3)BODIPY类 BODIPY类荧光素是由分子探针公司开发,以用来替代那些有部分缺陷的传统荧光素,普遍具有荧光产 量高, pH敏感性低(无离子变化),光稳定性强以及发射波谱窄的优点,故BODIPY类荧光素已被广泛用 于核酸,脂肪酸,磷脂以及各种受体。同时,由于在电泳过程中对序列片段影响小,故已被逐渐用于DNA 自动测序。但相对而言, BODIPY 类荧光素并不特别适合标记蛋白. BODIPY FL可代替 Fluorescein BODIPY R6G 可代替 Rhodamine 6G . . BODIPY
9、TMR 可代替 Tetramethylrhodamine BODIPY TR可代替 Texas Red 这些 BODIPY类荧光素具有与被替代物几乎类似的光谱特征,能共用同样的光过滤器与激发光源,但更 具优点。 (4)其他荧光素 Cascade blue Cascade blue 是在芘 (pyrene)结构基础上改造得来的, 即 sulfonated pyrene, 它是一种短波长紫外激 发荧光素 , 与另一种常用的紫外荧光素Aminocoumarin 相比 ,Cascade blue的 Em与 Fluorescein有更小的 光谱重叠 , 有更高的荧光吸收和更大的荧光产量. Cascade
10、 blue 在 376nm处存在第二个吸收峰,水中不稳定。 Cascade blue 主要用于标记蛋白, 作为极性示踪子 (polar tracer)可进行膜蛋白定位等. 但也能用于标 记核酸和葡聚糖。Aminocoumarin 一种短波长紫外激发荧光素,通常使用的是7-amino-4-methylcoumarin, 红移现象明显 , 比 Cascade blue 有更长的发射波长, 肉眼观察明显,更适用于confocal 。 表 1:主要荧光激发光源 Excitation source Principal spectrum lines(nm ) Mercury-arc Lamp 366,40
11、5,436,546,578 Xenon-arc Lamp 250-1000(continous) Tungsten-halogen Lamp 350-1000(continous) Cr:LiSAF Laser 430 Helium-cadmium Laser 325,442 Argon-ion Laser 488,514 Nd:YAG Laser 532 Helium-neon Laser 543,594,633 Krypton-ion Laser 568,647 表 2:主要荧光素一览表 Dye Abs/Em Max (nm) Notes Acridine orange 500/526 g
12、reen fluorescence bound to DNA, and red shift to 650 upon association with RNA, useful for flow cytometry. FAM 492/518 Most widely used green fluorescein, absorption overlaps the 488 nm spectral line of the argon-ion laser, prone to photobleaching, pH sensitive between . . pH 5-8,is widely used for
13、automated DNA sequencing FITC 494/519 Subject to argon-ion laser, widespread use for hybridization, immunoreagent, protein sequencing and FRET HEX 535/556 pH insensitive, used for automated DNA sequencing JOE 520/548 Intermediate-wavelength spectra, important dye for automated DNA sequencing. Lissam
14、ine rhodamine B 570/590 Optimal for 568 nm excitation photostable,used in confocal laser scanning microscope.easier to label protein than TMR. Pyrene 340/378 Excimer:470 Long excited-state lifetime, spectral shifts due to excimer emission,used in protein comformation and oxygen sensors. ROX 570/590
15、spectra between Lissamine rhodamine B and Texas Red, used in automated DNA sequencing. TET 521/536 pH insensitive, used for automated DNA sequencing Tetramethyl rhodamine 555/580 pH insensitive , photostable,Widely used for automated DNA sequencing Texas Red 595/615 Suited for the Ar-Kr 568nm and He
16、-Ne 594nm spectra, brighter and lower background than other red dyes as third label, used in confocal laser scanning microscopes Dansyl Chloride 372/ND Environmentally sensitive, large stokes shift for protei sequencing Dabcyl 453/none Broad absorption, no fluorescence, as a quenching group useful f
17、or fluorescence resonance energy transfer (FRET) CR-6G 525/555 Spectral between fluorescein and tetramethylrhodamine, good photostable, preferred nucleotide off protein Cascade Blue 400/420 Resistant to quenching upon protein conjugation, Water soluble. BODIPY R6G 528/547 Substitute for rhodamine 6G,Useful for automated DNA sequencing BODIPY FL 505/513 pH insensitive, narrow spectral bandwidth, useful for automated DNA sequencing, preferred protein conjugation. . . Amino-coumarin 345/445 Widely used blue fluorescent dye, visibly brighter and easier for microscopes
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