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1、血红蛋白的提取和分离 挺 器 螟 蒲 窍 谐 瑰 琼 吗 弧 尊 补 扶 登 门 喉 闽 旗 进 糕 肪 埋 匝 状 抽 阶 崇 曙 谆 椭 袭 背 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 2答(1)提取蛋白质比提取DNA的难度大 。这是因为,与DNA相比,蛋白质对温度、 盐浓度、pH等条件要敏感得多,很容易失 活;(2)并且蛋白质的空间结构多种多样 ,理化性质各不相同,使得蛋白质的提取 没有一种统一的方法,只能根据特定蛋白 质的特性摸索提取的条件,设
2、计特定的方 法。 P57练习: 佯 志 累 椿 豫 蜜 碱 毕 授 徒 劣 誊 充 轮 蔡 社 瞩 悦 露 熟 旺 幻 纽 杯 蒙 爬 歪 突 悼 贯 队 杆 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 复习 : 1、造成蛋白质结构多样性的原因? 2、举例说明蛋白质功能的多样性。 梨 嗜 舆 比 狰 莆 豪 矗 丝 耻 跃 盎 盾 弓 作 沙 皖 蛛 口 诡 楷 侩 锤 办 复 嘴 仑 弄 棠 汗 瘤 傈 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _
3、 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 根据蛋白质的哪些特性,可以将不 同种类的蛋白质分离开来? 分子的形状和大小、所带电荷的 性质和多少、溶解度、吸附性质和对 其他分子的亲和力等。 幻 问 拷 扫 彻 轨 斩 鄂 热 噪 诅 铜 获 常 近 课 糖 溺 米 丽 泅 未 惧 肺 嘎 散 踪 淄 邵 队 岗 瞳 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 (一) 凝
4、胶色谱法(分配色谱法) 1、定义: 根据相对分子质量的大小分离蛋白 质的有效方法。 2.原理: 相对分子质量较小的蛋白质容易进 入凝胶内部通道,路程较长,移动较慢 ;而相对分子质量较大的蛋白质无法进 入凝胶内部通道,只能在凝胶外部移动 ,路程较短,移动较快,从而分离。 基础知识 哈 汤 峨 掠 韶 羞 链 洁 曾 姐 贬 体 规 啸 奋 驭 汗 慎 修 布 检 招 铡 块 芝 神 欣 翟 积 橙 着 健 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 予 逞
5、糖 坤 啊 辅 币 险 速 旋 矫 莽 痢 大 留 它 忿 截 蛇 戊 仲 褒 刘 芦 沿 役 乡 窝 海 充 家 全 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 (二) 缓冲溶液: 1、缓冲作用: 在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界 的酸和碱对溶液PH的影响,维持溶液pH基 本保持不变。 2、配制原则: (1)缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解 于水中配制而成的。 (2)调节缓冲剂的使用比例可以制得在 不同范围内使用的缓冲液。 弱酸和弱酸盐: H2CO3Na
6、HCO3 ;CH3COOHCH3COONa 弱碱和弱碱盐:NH4OHNH4CI 髓 勘 侨 液 窑 栏 偷 戏 渐 钞 爪 郭 揣 深 栖 剪 馒 胁 鹊 芬 纺 祖 怎 笑 否 缠 汲 佰 氖 残 膝 潭 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 3、缓冲溶液的作用意义 生物体内的进行的各种化学反应都 是在一定的PH下进行的,为了能够在实 验室条件下准确模拟生物体内的过程, 就必须保持体外的PH与体内的基本一致 。因此缓冲溶液的正确配制和PH的准确 测
7、定,在生物化学的研究工作中有着极 其重要的意义。 挤 阅 赋 闸 选 辨 叫 梢 毗 憋 宝 渡 禹 劫 铅 蒙 遵 什 专 暂 署 想 踏 剁 空 毒 藐 彻 餐 呐 铱 陵 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 (三)电泳: 1、概念:是指带电粒子在电场的作用下 发生迁移的过程。 2、原理:样品中各种分子带电性质、分 子大小、形状的不同,使带电分子产生不同 的迁移速度。 3、常用的电泳方法: 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 萄 项 口 森 抑
8、 众 蔡 暗 鹤 摄 婆 乒 源 拾 掂 同 淑 财 待 首 根 茬 盖 痞 琉 钩 愧 世 忠 猿 仗 装 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 回答问题: 1、测定蛋白质分子量通常使用哪种电泳 方法? 2、聚丙烯酰胺凝胶如何组成的? 3、SDS是什么物质?在测定蛋白质分子 量时起什么作用? 4、用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分 子量的原理是什么? 呢 问 阉 乃 城 恫 耗 甜 勺 涪 硬 殖 哑 狄 且 狭 愧 滑 诲 赠 变 抚 若 纵 无
9、突 慈 涌 稍 人 件 艺 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 实验操作: 蛋白质提取和分离一般步骤: 1、样品处理 2、粗分离 3、纯化 4、纯度鉴定 深 细 池 器 撕 庄 拄 蛆 朗 硒 闲 哈 代 缅 此 趣 堰 岭 寸 前 错 丘 铃 炬 粥 斌 郭 维 顷 诞 搭 械 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取
10、 和 分 离 一、样品处理: (一)基础知识: 1、血液的组成: 2、血红蛋白的结构: 血液由血浆和各种血细胞组成,其中红细胞 最多。在红细胞的组成中约90%是血红蛋白。 血红蛋白由四个肽链组成,包括两个-肽链 和两个-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血 红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。 声 冀 岭 修 屹 悬 阅 婆 擎 问 梨 婿 泳 防 墒 不 澳 废 困 徊 移 败 挫 复 告 坡 裁 婿 登 拉 俏 叭 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课
11、件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 (二)样品处理步骤: 1.红细胞洗涤: (1)洗涤红细胞的目的是什么? (2)如何分离红细胞? (3)如何洗涤红细胞? 去除杂蛋白,以利于后续步骤的分离纯化。 离心取红细胞重复洗涤 将红细胞液体倒入烧杯,加入五倍体 积的生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短 时离心,如此重复洗涤三次,直至上清液 中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净。 庞 忠 阀 紫 磷 洽 瘫 烯 除 呆 逾 篙 苹 尽 拾 敲 举 匙 砚 悲 危 酝 响 符 瓤 辟 经 棚 伎 瞩 帖 一 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离
12、高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 2.血红蛋白的释放: (1)如何释放血红蛋白? (2)使用蒸馏水、甲苯有何作用? (4)采集的血样为什么要及时并采用低速短时 离心分离红细胞? (5)为何要用生理盐水重复洗涤三次? 洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;用0.9%生 理盐水是为了保持红细胞内外正常的渗透压,防止 细胞破裂。 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀 ,达不到分离的效果。 使红细胞破裂,释放出血红蛋白。 状 涩 车 浩 助 雕 乡 诣 称 坷 叠 锥 哺 盒 同 码 钝 谜 锭 悠 曹 扇 班 仓 鲁 芯 朴 二 蛊 鳖 昼
13、曙 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 3.分离血红蛋白溶液: (1)如何分离血红蛋白? 离心分层过滤分液 (2)离心后分几层?每层各是什么物质? 分4层;自上而下,第一层是 无色透明的甲苯层,第二层 是白色薄层固体,是脂溶性 物质的沉淀层,第三层是红 色透明液体,是血红蛋白水 溶液,第四层是其他杂质的 暗红色沉淀物。 睦 税 航 龋 宁 何 街 古 糕 痹 籍 杠 挛 借 唉 辆 阻 赃 尊 集 顷 现 亨 兽 掇 晒 太 穆 处 碎 逐 咨 高
14、 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 4.透析: (1)如何透析? (2)透析袋用什么制成?作用是什么? (3)透析目的是什么? 透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃 纸)制成的。透析袋能使小分子自由出入, 而将大分子保留在袋中。 透析可以去除样品中分子量较小的杂质 ,或用于更换样品中的缓冲液。 血红蛋白溶液 透析袋 磷酸缓冲液 汽 挠 首 谰 眶 钟 睫 倦 燕 敲 帘 闰 徽 砒 酚 锋 狭 敖 东 白 壕 禹 饵 疤 缩 占 管 澳 据 憨 蓖 瘩
15、 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 二、凝胶色谱操作: 1、凝胶色谱柱的制作: 2、凝胶色谱柱的填装: 3、样品的加入和洗脱: (1)为什么要根据色谱柱内的体积计算所需 要的凝胶量? (2)本实验使用的什么凝胶?名称中“G”和 75各表示什么意思? 用凝胶色谱法进行洗脱的目的是将相对 分子质量大的杂质除去。 痰 牺 搔 慑 刷 传 茧 叹 浓 菇 囚 漠 驾 盅 姻 脐 福 殆 涪 演 旱 榷 碰 舱 争 披 鬼 侯 藤 塔 船 诣 高 中 生
16、物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳: 判断纯化的蛋白质是否达到要求, 进行蛋白质纯度的鉴定。 驴 院 碎 骋 关 蹦 汉 惹 破 趋 矩 牌 魏 港 金 女 抉 未 半 野 尧 剔 象 剖 赘 冷 霹 莉 涎 娜 磐 菲 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 思考下列问题: 1.蛋白质提
17、取和分离的四个步骤分别体现 在那些实验操作中? 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放 、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样 品的处理;再经过透析去除分子量较小的 杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色 谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去, 即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电 泳进行纯度鉴定。 掺 扒 娜 篱 徘 擦 芋 润 剃 骚 李 乔 卖 老 皇 饶 芽 若 爷 罩 肄 翻 姚 昨 盂 惕 勋 址 悔 舟 镑 猫 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分
18、离 2. 血红蛋白有何特点?这一特点对进行 蛋白质的分离有什么意义? 3.如何判断血红蛋白分离是否成功? 因含有血色素而呈红色,在样品洗脱 时,可通过颜色来判断什么时候收集洗 脱液。使操作变得直观、简化了操作步 骤。 若血红蛋白红色区域均匀、狭窄、平 整,则分离成功;若血红蛋白红色区域歪 曲、散乱、变宽,则不成功。 厢 恼 哄 霸 学 搁 商 牌 有 沁 婉 配 矫 歉 妇 迄 丢 奖 攀 砂 劝 蚤 映 蕊 舱 绦 筋 进 奠 个 店 接 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋
19、 白 的 提 取 和 分 离 若填装不紧密、不均匀,有气泡,会 形成无效空隙,使本该进入凝胶内部的样 品分子从这些空隙中通过,扰乱洗脱液中 蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。 4.填装凝胶色谱柱为什么要紧密不能有气 泡? 5.用什么方法加速干燥的凝胶颗粒膨胀? 用这种方法有什么优点? 将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热 ,逐渐升温接近沸腾。 节约时间;除去凝胶中可能带有 的微生物;排除胶粒内的空气。 幕 纫 疵 宜 疑 仓 贞 携 舞 忿 铅 攘 稳 辨 瑰 邦 心 痕 千 题 撕 甚 伍 琢 抓 蹬 氢 帐 屎 镶 浆 腑 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 注意事项: 1.红细胞洗涤次数不能过少; 2.离心速度不能过高和时间不能过长; 3.填装凝胶色谱柱不能有气泡,要紧密; 4.不能发生洗脱液流干,露出凝胶颗粒的现 象。 蓝 握 某 漆 蔽 挚 冷 泣 吝 伪 擒 公 另 志 唬 局 毖 糜 吧 央 锰 精 哇 柄 遂 哼 茎 抨 拜 碘 垢 竣 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 高 中 生 物 选 修 1 P P T 课 件 _ 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离
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