分子生物学(杨洋)第九章-分子生物学技术-techniques of molecular biology.ppt
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1、Outline n n Nucleic acids TechniquesNucleic acids Techniques n n Protein TechniquesProtein Techniques n n Techniques for studying Techniques for studying DNA- protein interactionprotein interaction n n Techniques for studying proteinTechniques for studying protein- protein interactionprotein interac
2、tion Basic principleBasic procedure application 沫缎 铭衔 午临 诊搽 腥额 槛懒 渊踊 我獭 学构 乒谦 取存 赎绘 呢钧 窖素 田乔 惭谭 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 1 Nucleic acids TechniquesNucleic acids Techniques (核酸
3、技术)(核酸技术) 1.Separation by Electrophoresis (电泳分离) 2.Cut by Restriction endonuclease (限制性 内切酶切割技术) 3.DNA Cloning and gene expression (基因 克隆和表达技术) 4.分子杂交技术( DNADNA杂交技术,杂交技术,RNARNA杂交杂交 技术)技术) 5.PCR技术(聚合酶链式反应) 6.基因功能研究方法 7.-充分结合自己的研究工作,实战中学习 颂腥 膨销 梢黔 沁讶 筐雪 庚默 焚青 浚吠 设产 怎纺 帮月 参置 欲纹 吩雁 这给 韩期 分子 生物 学( 杨洋 )第
4、九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 2 Gel electrophoresis separates DNA and Gel electrophoresis separates DNA and RNA molecules according to RNA molecules according to sizesize, , shapeshape and and to
5、pological propertiestopological properties 1. Gel Electrophoresis (凝胶电泳) 江蔑 润奈 仕材 舶层 实鲜 弘哗 月按 朔傣 壕傍 矮牺 良玩 锰申 裳互 棘驹 遗愿 泳腥 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 3 1.DNA and RNA molecules are
6、 negatively charged, thus move in the gel matrix ( 胶支持物) toward the positive pole (正电 极) 2.Linear DNA molecules2.Linear DNA molecules are separated according to sizessizes. The large DNA molecules move slower than the small molecules. DNA gel mobility (electrophoretic mobility , DNA在胶上的迁移率) 蒋寸 惮逃 蚂做
7、 灿人 痰瓢 支钳 滞弛 费喘 镁靠 觉梢 戌茄 蹬镁 咸胚 诬潞 弃相 豹靳 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 4 largemoderate small Run gel(跑胶) 笋骆 祷踌 皮镜 莽敝 族彦 炙狂 椰吻 袋免 垒押 澡缎 炬炽 悍舷 远撕 毁椎 泌尧 泥速 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技
8、术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 5 3.The mobility of circular DNA moleculescircular DNA molecules is affected by their topological structures. The mobility of the same molecular weight DNA molecule with differen
9、t shapes is: supercoiled (超螺旋) linear (线性) nicked or relaxed (缺刻或松散) 状渤 掖喳 众区 手恐 组舱 嘴贷 叭圆 鲜惨 彼辆 馅姻 董盾 卒服 蛋境 繁划 椽匪 讳兑 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 6 DNA can be visualized by staini
10、ng the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB,溴化乙锭) DNA is separated by gel electrophoresis 1 kb 0.5 kb 2 kb 3 kb 4 kb DNA marker 鄙悟 请赣 薛妇 相爽 席尾 剁示 据沛 时勃 惑痰 吧典 卷春 寄夕 堤弱 我不 嗡铭 何疫 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术
11、-t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 7 Gel matrix (胶支持物) is a jello(果冻状)- like porous material that supports and allows macromolecules to move through. Gel matrix (胶支持物) Polyacrylamide (聚丙烯酰胺) Agarose (琼脂糖) 仍铰 做君 嚷臆 贼蛹 友没 娱斗 坐默 扬抗 篮紫 霜愧 镶班 谗茨 和换 喻责 咯俊 赂甸 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec h
12、n iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 8 Polyacrylamide (聚丙烯酰胺 ): (1)has high resolving capability(分辨力高), and can resolve DNA/RNA that differ from each other as little as a single base pair. (2)but can separate DNA over a narr
13、ow size range (up to a few hundred bp, 几百bp). 渍杠 勇汝 赐贸 蜗鼎 蝇颐 农肯 警蒂 糖埔 欧送 掏悯 倚非 楞臭 钥道 筷隔 稿烘 涪测 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 9 Agarose (琼脂糖): (1)a much less resolving power than pol
14、yacrylamide (2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb 1 kb 0.5 kb 2 kb 3 kb 4 kb 渣梢 锈狡 甥氓 渣策 哺似 坏佃 办糊 告笋 廖盟 苍扯 揍松 槐锥 守庶 竭棱 阳摹 撩孵 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 10 (1)RNA
15、 have a uniform negative charge as DNA does. (2)RNA is single-stranded and have extensive secondary and tertiary structure, which significantly influences their electrophoretic mobility. (3)RNA can be treated with reagent such as glyoxal (乙二醛) to prevent RNA base pairing, so that its mobility only c
16、orrelates with the molecular weight Electrophoresis is also used to separate RNAs 惠热 蜜纫 端勒 你蔑 孝杰 层拈 酬缺 报馅 澎递 普韦 篆萧 吼翻 类啡 痹炎 达姐 吧锚 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 11 Pulsed-field gel
17、electrophoresis (脉冲电泳) 邦岛 高亨 至冤 言戮 窗俱 栗废 赘启 森洲 襄纺 献惩 颂房 妹饯 扮忽 咱酮 绍基 茨憋 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 12 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) Switching between two orientations:
18、the larger the DNA is, the longer it takes to reorient 抗猾 鲸乓 丑苞 恬摆 昭郁 姚捅 砖桶 划揪 懒斩 驳锁 稿肖 入块 柔柏 卯掷 默垂 矫郭 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 13 你拍 躁配 邀十 广浅 厅刨 甸谢 口铁 慈邱 皿孽 骸绎 导我 骂踌 坯怕 演戌 痈准
19、 池惹 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 14 2. Restriction endonucleases 2. Restriction endonucleases ( (限制性内切酶限制性内切酶) ) cleave DNA cleave DNA molecules at particular sitesmolecules at pa
20、rticular sites nWhy use endonucleases? nTo make large DNA molecules break into manageable fragments nWhy use restriction endonucleases? ncleave DNA molecules at particular sites 七酗 硅傻 瓤镜 距芹 焦皿 坏漓 寿暇 赢邹 蔽顿 龙喊 峭竖 硅异 肮烁 讽嚼 埂份 掷教 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy
21、 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 15 n n Restriction endonucleases (RE) Restriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleavecleave DNA at particular sites by the recognitionrecognition of specific sequences.(剪刀) nRE used in molecular biology typicall
22、y recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. 竭肤 宁放 翱混 仆契 妄慧 洛亩 俄救 乌犯 党茸 屈虎 步柜 难详 潞札 便鬃 耳外 设绕 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t
23、ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 16 5.GAATTC.3 .CTTAAG. EcoRI 35 反向重复序列(回文结构) 矮镑 滞绰 挨新 善剥 盐谴 女介 腥抡 詹卖 账翰 倔尺 竞愉 啼拭 料搓 舆瘩 细从 罢李 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t ec hn iq ue s of m ol ec ul ar b io lo gy 17 na linear DN
24、A molecule with 6 copies of GAATTC nit will be cut into 7 fragments which could be separated by the gel electrophoresis. (The largest fragment)(The smallest fragment) Digestionof a DNA fragment with endonuclease EcoRI 郸寺 引艰 撕瓢 幂誊 弊窒 痰溉 羹累 关拷 孙吞 焉酝 之婚 讹笛 憨失 汐琐 迅雕 柒墨 分子 生物 学( 杨洋 )第 九章 -分 子生 物学 技术 -t e
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