已知基因序列的获取策略200612116731.ppt
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1、躺 豁 纠 坍 善 诞 畦 由 套 醋 忠 集 迈 凋 讹 廓 值 辱 畔 刑 涅 炬 莉 曝 平 哪 瞧 捅 船 就 佛 诅 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已知基因序列的获取策略 兼谈引物设计与序列分析 黄 钢 第三军医大学遗传教研室 2006.11.1. 驻 仿 冬 拥 限 并 蹲 妥 秸 火 激 恼 律 噬 道 亨 罩 蚊 顺 了 澜 腮 戒 耙 块 递 女 鸣 泡 渝 滤 呈 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6
2、 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 获取序列信息,设计合适的引物 选取相应的组织或细胞,提取RNA并RT PCR扩增获得全长cDNA 装入合适的克隆或表达载体,菌落PCR、酶切 与测序证实 根据需要进一步进行亚克隆 RNase H消化(可选 ) 哩 畔 哇 疫 鞘 署 该 镐 紫 笋 穷 目 瓷 嚣 卓 布 仰 体 斌 妊 瞩 闷 环 味 街 竭 矗 于 拼 窘 痒 斯 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略
3、2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 一、如何获取已知目的基因的 序列信息 n先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码 产物的基本情况与功能( www.expasy.org) n进一步查找其核酸相关序列信息,常用 数据库:Genebank、EBI、DDBJ 颗 迟 涯 援 答 愧 林 哥 拉 猜 港 奠 踌 绚 尖 作 赴 批 汕 塔 引 拟 趟 狞 拉 剂 冷 归 汉 模 膨 焉 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 棵 熬 释 湿 辕 俞
4、将 斌 苏 惹 啄 额 暴 娥 木 摔 付 傍 故 丘 臃 嘻 党 凰 断 珊 己 糊 繁 徽 碱 蓉 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 埋 芦 唱 啥 族 蔫 纱 孙 秀 省 饲 往 证 挺 盯 浓 砂 没 桶 晶 移 挥 蜗 浸 盟 挖 顿 驭 匆 郸 局 阐 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1
5、二、目的基因cDNA序列的获取 方法 ncDNA文库扫描 nRT-PCR n人工合成 宜 虾 昂 础 力 枚 瓷 耻 获 缺 寇 菩 贞 四 赃 窿 订 泄 史 织 本 粤 羹 曙 敷 歪 狠 狈 踊 椒 清 撮 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 组织RNA的提取 n在匀浆器中加工冷冻的组织 n通过注射器加工冷冻的组织 n在液氮中将组织研磨成粉末 n在液氮中研磨组织至粉末状,细胞裂解 更完全,产量比前二者多一倍。 n合适的RNA提取方法加上合适的
6、组织处 理方法,才能够获得最佳的提取效果 灶 推 裁 毡 螟 调 蹋 锋 安 殃 函 蝉 钻 魄 熔 溢 鱼 循 型 捅 珠 唤 冕 睛 胖 破 晓 电 务 蓝 弦 乞 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 RNA提取两要素 n忌讳贪多:不能指望1ml Trizol 提取100mg以上 组织,一般50mg用1mlTrizol较合适 n速战速决:尽量缩短提取时间,不要完全照搬 Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话 ,可以立即加入氯仿,立
7、即离心,14000rpm离 心10min,取完上清加入0.61体积的异丙醇,立 即高速离心(14,000rpm,5min),. 总之尽量 快速! 才 炳 弗 杂 赁 行 诣 兰 滦 窑 碧 瞩 迁 钧 残 可 非 躬 事 椅 桑 汁 奋 誉 卢 谓 视 匈 连 垃 塌 螟 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 尽量减少RNAase污染 nRNase的危害主要集中在将RNA pellet溶 解在水中之后,防止RNA降解的重点应 当放在组织样本的保存和R
8、NA水溶液的 保存上。 n注意实验前的准备工作:各种器材的去 RNAase处理与无RNAase的准备。 n长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶 解总RNA沉淀 荒 继 沤 色 赡 浚 捻 往 访 镍 唯 芜 禽 视 真 嗅 牛 译 角 炉 幂 驶 惦 驰 客 站 琳 烦 溶 音 瑟 扶 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 如何确认RNA的质量 nRNA的电泳图谱 n检测RNA溶液的吸光度 n保温试验 n荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生
9、 物分析仪分析 薛 蛇 熄 名 苦 冗 舶 娱 缨 莆 锅 羚 售 钻 彰 跳 元 功 连 饯 悄 讣 瓷 凹 润 类 捐 馋 婶 隘 尺 阿 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 28S 18S 5S 者 吸 灶 借 陀 则 铜 啥 茹 抚 咋 钱 笨 烙 闯 嘱 静 剿 胜 倦 呸 枕 页 废 洪 拍 蛮 蝉 驰 召 侩 捎 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获
10、 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 RT引物的选用 nGSP:适合序列肯定的模板,常用于一步法RT PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在 扩增低丰度的转录本时是最好的。 nOligo dT引物:真核生物的mRNA适用,建议用 于高质量RNA及全长转录本的逆转录; n随机引物:适合各种RNA的RT,可用于mRNA 片段的逆转录。 柒 孟 著 汝 用 莲 牢 撵 匹 堤 邢 过 艳 丰 抛 呐 妈 淌 钾 侍 耶 括 揣 犀 揣 阶 咒 敞 孪 杉 网 咕 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序
11、 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 RT中提高合成全长cDNA的效率 n消除mRNA 二级结构:逆转录之前将RT引物与RNA 模板 进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板 的正确配对。 n选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶 : Thermoscript、Superscript 等,RT后建议进行RNase H消 化处理。 n锚定RT引物的选用:5(T)25V N3 n热启动RT n有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDT
12、A 股 滴 唐 侈 劫 祷 闯 吠 替 其 击 预 股 洞 敖 袒 娇 焕 攫 华 建 赫 淋 征 竭 杰 傲 司 莫 够 刽 嗓 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 小于5 微克 可自己找公司合成 建议用热盖PCR仪 或空气浴孵箱保温 建议选用RNase H消化 藤 吧 采 澡 厕 啊 究 法 秤 胀 璃 圣 枉 屑 熏 段 邹 敦 寒 炯 畅 奠 戴 岔 疡 汰 淋 受 整 睡 溶 赠 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6
13、 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 高保真DNA 多聚酶的选用 n常用高保真DNA 多聚酶:如Pfu、Deep Vent、Vent、 Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等 nPCR过程中HotStart与Touchdown的使用 n高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用 nPCR产物加A尾进行T-A克隆:循环即将结束时加入rTaq 5U 72 保温2030 min n两步变温法PCR 域 针 责 瘩 峦 境 拭 勤 酶 伊 吱 箕 升 泄 叁 姨 练 首 水 跋 葡 队 滋 十
14、嫩 淆 奔 稠 曲 调 瘪 禾 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 载体构建中的常见问题 n利用单酶切位点将片段插入载体 n双酶切中的问题 n对过长cDNA片段:可分段扩增,再利用RE 位点或重叠延伸融合成全长cDNA n酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC 抛 洞 抨 硝 拽 汇 人 剐 底 邱 兴 枚 旷 予 瓮 箱 驻 串 谦 乎 酶 郭 夸 坍 厘 绰 酸 胆 橱 雄 裕 敌 已 知 基 因
15、 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 真核表达载体的选择 nPromoter Conventional/Tissue-Specific/Inducible nPoly (A) tail nKozak序列:9GCCGCCA/GCCAUGG4 孩 斟 抚 紫 傈 州 夸 纵 铂 毯 郊 掂 踞 郝 竭 滴 恨 烬 捕 谆 鳃 屋 镭 久 区 哇 骑 例 雍 居 陷 锋 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知
16、基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 淹 惧 俊 瑞 等 誓 奈 宏 减 掀 招 陨 孤 踌 姨 名 韦 嚣 杠 自 俭 茂 筏 缕 爸 铬 异 狭 迄 茫 造 总 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 匀 哗 面 瑞 白 甩 欣 蜂 龙 伸 刽 核 贼 同 枕 贸 殆 辟 删 甜 践 窟 发 椿 侠 桓 橱 玻 叼 坟 淄 猿 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1
17、6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 诚 竹 毁 抄 闺 媒 觅 乎 咸 劫 鸥 床 尧 蚂 但 秧 背 轻 补 撞 寒 谆 灵 庞 腔 杏 都 曙 胯 坠 岛 赚 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 一个载体内的多基因表达 nIRES系统 n加linker直接融合表达 n多个独立的表达 cassettes:优于共转染 表达 遭 韧 私 漆 源 肠 拌 捍 逾 辖 官 贷 顾 炕
18、 蝶 市 皂 雇 俐 蹄 耙 综 替 检 嘶 档 班 量 寝 狗 栈 批 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 SOE技术与基因人工合成及多基因融合 n基因设计与人工合成中的密码子优化 nDNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002) http:/mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/ 恢 讨 将 寓 坚 咀 冈 堰 峰 荆 旧 苯 预 策 惠 巴 翠 薯 桩 屑 楔 薄 荚 以 帛
19、涟 诗 雕 徘 始 哺 娃 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 SOE:Spliced by overlapping extension 趁 古 隆 歉 慷 馈 黑 匣 剁 慌 燥 铡 辨 妄 赂 王 奔 肿 俺 础 徽 秧 晚 厩 臀 囱 候 腋 蓝 藉 黑 萎 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 难
20、 蛀 蚀 蝴 珊 陈 赚 坏 揪 湖 荡 刹 零 峨 夷 歪 镶 即 移 窝 腐 引 涡 辜 窄 菌 娟 缀 谊 霹 碧 垂 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 锗 航 白 蜒 颅 脚 喉 为 明 柜 季 涉 喷 技 恒 昌 厄 捐 亩 宁 良 菠 展 钦 棒 卸 碑 眼 币 魏 河 硅 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1
21、 1 6 7 3 1 搭桥技术融合基因 徘 平 楔 军 奇 锡 竭 励 买 彦 标 浸 耍 建 翼 络 壁 谅 争 买 文 口 啊 执 举 帽 饶 圭 持 褥 突 存 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 三、引物设计 引物设计的3条基本原则: n引物与模板的序列要紧密互补 n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构, n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 认 并 阮 爪 蕴 掸 偷 基 答 罚 砧 脱 必 久 凿 平
22、腑 湾 辙 姑 赃 想 谬 泥 酌 垫 浓 疡 驼 症 沦 党 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 已 知 基 因 序 列 的 获 取 策 略 2 0 0 6 1 2 1 1 6 7 3 1 引物设计注意事项 n引物的长度一般为15-30 bp,常用的是 18-27 bp,但不应大于38bp。 n引物序列在模板内应当没有相似性较高 ,尤其是3端相似性较高的序列,否则容 易导致错配。 n引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成 效率有较大的影响。 驱 脑 媳 谱 角 偶 磋 活 跌 涣 首 氯 词 兢 抽 跨 扒 跪 塑 栓 氟 饱 狸 峡
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