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1、蛋白质纯化技术 Protein Purification Techniques 汤丽霞 电子科技大学 气 娩 吕 见 罢 悼 掐 言 苯 邵 频 骑 亏 挑 舔 例 钞 雨 腮 檬 恩 伟 奴 撑 述 飞 耿 袄 巨 加 惹 弓 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Textbook and References 教材: 蛋白质纯化技术及应用 陆健 化学工业出版社 参考书目: 生物化学实验技术 何忠效 化学工业出版社 生物化学技术原理及应用 赵永芳 科学出版社 诞 谷 偿 摘 写 螺 燎 蓟 牙 疙 她 唯 嫡
2、龙 声 谚 溯 澳 舆 慧 吱 龋 泼 御 饯 嘶 飞 涟 刊 挥 叁 皿 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Exams 平时成绩(10):出勤+作业; 期末考试(50):对已学知识掌握和综合 运用能力的考察; 实验成绩(40):动手能力+实验报告。 48学时包括:授课(16学时)+ 实验(32学时) 库 朱 亏 辣 辟 掩 惧 蔫 饰 蓉 河 聘 葛 揍 捐 包 儒 沈 扩 湃 尚 官 穷 羞 梢 噎 眶 蕊 点 窃 锗 谢 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯
3、 化 c h a p t e r 1 Outline Chapter I Protein Isolation 蛋白质分离 2 学时 Chapter II Purification Techniques 纯化技术 10 学时 Chapter III Strategies for Special Protein Purification 几类特殊蛋白质纯化策略 4 学时 球 败 侈 局 毡 昼 畸 誓 笨 筹 域 卿 挫 外 宁 铭 塌 颁 邪 屈 都 返 阵 虐 贝 内 屈 垮 唤 呕 赃 铲 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p
4、 t e r 1 Why do protein purification? To gain insight: 研究蛋白质结构与功能基础 For use in mdicine: Insulin(胰岛素) Blood Factor VIII (hemophilia) Glucose oxidase and peroxidae (葡萄糖检测) For use in industry: biocatalysis 恕 绷 柱 企 同 守 拭 隙 鹤 杉 皿 垮 坪 裂 杉 残 构 坯 殉 釜 邵 宜 检 谗 募 袄 伴 蚂 煽 厢 摩 顾 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋
5、白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 How to do ? Natural source Recombinant source Expression Sample preparation Chromatographic purification Storage Stop ? 来源 前期处理 纯化 物 姬 罪 淘 朝 随 丈 须 沸 铺 收 渗 婿 浆 甭 飞 赴 熔 烹 摈 好 菠 缕 博 合 报 唐 麓 纺 害 胖 缅 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋白质分离纯化过程 Ammoniu
6、m sulfate fractionation Cell Organelle Homogenization Macromolecule Nucleic acid Carbohydrate (Lipid) SizeChargePolarityAffinity Small molecule Cell Debris Protein Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric foc
7、using Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics 材料选择与处理 粗分级 细分级 帛 厩 羊 困 驹 蜀 镑 犁 秆 傲 诲 盟 绣 恍 姥 亲 壳 慨 赁 齿 御 滞 簇 香 婴 摸 蝉 犊 述 全 酋 蜀 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 根据需求设定方案 Functional studies Mass Spectrosc
8、opy Antigen for immunization Structural studies pgnggmg moderate80% high 95-99% protein amount required; purity requirement 炸 泌 幕 颊 谅 铝 危 降 兆 饶 辟 奈 恭 糜 丙 猖 猾 扭 窗 粉 枉 柒 令 戚 婆 丁 患 辛 掐 克 祥 耐 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 尽量遵循以下原则: As few steps as possible(步骤尽量少) As short a
9、 time as possible (时间尽量短) Low Temperature: to keep activity (保持活性) 晰 缕 樟 锥 低 祖 殉 埔 权 稗 尊 摈 漠 酿 坛 惯 栗 允 跃 居 字 盈 坟 厚 钥 俊 噎 跪 杂 雨 协 霹 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Purification is a tough task 1、生物材料的组成极其复杂 木瓜蛋白酶 (papain) 止 拈 谐 古 螺 方 泌 虑 压 以 棘 添 糖 涟 琵 库 伊 吵 蛹 酣 馆 圈 府 讨 责 负
10、 贴 里 陪 财 惟 椅 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Purification is a tough task 2、目的蛋白含量极微,只达万分之一,几十万 分之一甚至百万分之一。 生长素释放抑制素生长素释放抑制素 (SS) (SS) 抑制和调节多种激抑制和调节多种激 素的作用素的作用 从动物脑中提取从动物脑中提取: : 5mg-5mg-5050万只羊脑万只羊脑 基因工程基因工程 9 9升大肠杆菌升大肠杆菌 培养液培养液 盒 廉 呕 耪 族 监 霓 戎 蓑 横 为 主 辗 时 跪 集 檄 镶 讨 避 歼
11、机 涉 襟 澄 挑 驯 贪 叛 讣 嚷 棘 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋白质纯化好比爬山 炉 用 姻 噎 眼 惊 孝 怀 蚤 宠 渡 节 儡 冻 剧 胞 桨 梦 饮 氨 戎 泊 雄 窖 耿 筐 赫 郑 押 侄 梧 惜 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 材料选择及处理 细胞破碎及分离 Chapter I: Protein Isolation 继 厕 媒 撮 傀 涩 表 鼻 酿 洲 夕 听 徊 芦 湘 漾 扩 魁 析 岛
12、 磺 然 赦 荤 蛀 争 旭 烁 通 揪 妖 州 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 1.1 材料选择及处理 材料的来源:动物、植物和微生物 选材的基本原则: 有效成分含量高、稳定性好; 来源丰富、易保鲜; 提取工艺简单、成本低等。 材料处理: 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分; 植物要先去壳、除脂; 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 垛 帖 昆 寿 题 九 辽 截 鱼 讹 象 翟 蜡 灌 蓬 两 咙 代 拙 谨 剂 宫 眉 芯 烷 拉 旬 壹 虐 乒 晓 搀 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h
13、a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 材料选取有效成分含量高的部分 主要存在于番木 瓜的根、茎、叶 和果实中,以未成 熟的果实乳汁中 含量最高。 木瓜蛋白酶 骇 滞 计 日 痉 攀 桑 搏 进 臻 澜 录 搭 宽 熄 淳 幻 胰 嚼 卓 恶 呜 惹 室 呈 则 不 蔓 沁 鞠 诅 霞 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 体外重组表达 诱导表达及纯化 获取蛋白的主要来源之一 构建表达载体 铲 梨 纪 吓 侧 捎 徊 院 锌 嫌 做 御 永 旷 阮 脏 臭 鹤 徽 房
14、瞥 滇 柯 探 愈 眩 砂 揩 菜 隐 臭 隙 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 1.2 细胞破碎和提取 细胞破碎:The first step in the purification of most proteins is to disrupt tissues and cells in a controlled fashion. 炊 逗 掇 微 肇 仍 朋 算 扼 汤 陡 孩 郁 朽 滋 铰 程 屡 耗 绞 术 蕴 束 冷 宗 浆 菜 凋 之 炕 血 彼 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e
15、r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 细胞破碎方法 研磨法 高速匀浆 超声破碎法 压榨 冻融 表面活性剂 或脂溶性溶剂 酶法 机械法 化学法 生物化学法 物理法 构 篓 澜 陵 呕 使 疥 禁 锚 死 兜 慧 劫 阔 哀 茸 彝 盖 吕 坚 吩 请 向 挪 先 绣 棱 唬 逐 挽 永 纤 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 细胞破碎方法 研磨法:一种机械破碎细胞法 适用于动物组织,细菌和植物 加入石英砂或经液氮处理以提 高效率。 高速珠磨 施 狂 气 漠 息 第 尚 淹 捕 钾 后
16、 栋 烦 鳞 切 向 萎 淬 箩 锐 赞 张 凄 刻 昂 瓦 俺 缝 远 拭 敏 苹 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 细胞破碎方法 超声破碎法:借助超声波的振动力破碎细胞。 适用于微生物材料, 破碎效果与菌体浓度、超声频率 以及时间有关。 此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热。 负 椅 凯 澳 忍 粟 贞 刃 宵 染 苇 颜 志 戏 案 荆 尺 督 婿 丑 好 舱 闹 噎 砂 蒲 悍 末 兰 浓 介 玖 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p
17、 t e r 1 细胞破碎方法 压榨法:压榨是一种温和的、 彻底破碎细胞的方法。 缺点是仪器费用较高。 侈 暮 冉 梭 枣 才 布 迸 吝 锐 笋 务 胆 佑 俊 畔 般 麦 操 目 冕 纫 翻 艾 寒 舍 断 史 舆 涤 蜡 悯 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 细胞破碎方法 化学法:脂溶性溶剂或 SDS(十二烷基磺酸钠)等表面 活性剂处理细胞,可将细胞 膜溶解,从而使细胞破裂。 刚 久 寻 金 导 傀 苟 盛 茶 环 攫 窖 倍 峙 曼 钥 枫 架 无 哗 嘘 膨 催 总 撰 罗 夜 琶 格 假 幅 景
18、蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Fractionation(分离): Centrifugation is the most widely used procedure to separate the homogenate into different parts, or fractions. 喀 杏 裕 呵 鲁 霖 纪 滥 菇 柯 墓 馒 氟 栗 解 域 烂 忙 姨 嘻 咬 粪 样 叉 六 爵 脾 尸 球 菌 嚷 茶 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c
19、 h a p t e r 1 离心机 固定角转子 F=M2r 恢 儿 卓 拈 湃 氖 碴 捶 脏 屡 健 计 堂 漫 挫 拘 兹 抗 潍 潍 霖 经 亩 岔 潍 铲 余 兰 宏 观 已 叔 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 悬浮式转子(水平转子) 猖 鳞 鲤 码 樟 昼 拾 油 嫁 哈 稳 染 癌 座 噎 棍 折 惭 鲜 厉 使 霸 锑 嫂 予 嫉 秽 综 楷 瓤 淹 针 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 沉降系数 (sed
20、imentation coefficient) 沉降系数:即生物大分子在离心力场的 作用下,从静止状态到达极限速度所需要的时间。生 物大分子在离心时,其分子量、密度、形状等均对其 沉降速度有影响。沉降系数就是用来描述此沉降性质 的。 生物大分子沉降时间通常为120010-13秒范围; S=10-13秒 搐 校 趁 蓑 壕 轿 昆 橇 脉 椽 眩 晒 扇 催 穴 脖 降 拎 屹 紫 彩 贮 较 沽 墓 淫 绢 蜘 勒 苦 氦 北 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Chapter I 小结 对蛋白质纯化过程大概了
21、解 细胞破碎方法(重点) 沉降系数(理解掌握) 咕 均 猾 杉 涛 伺 棒 枉 舆 张 蟹 谢 圣 怕 磷 甜 铲 择 咐 顷 栓 荒 埋 尧 消 辕 樊 怠 末 欢 呛 椰 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 补充一:确定目标蛋白检测手段 u Detection and quantitation of targeting protein u The assay should be: Specific: 专一 Quantitative:定量 Economical in terms of time and mat
22、erial:简便经济 拱 恫 洒 灭 宰 迸 策 寨 堕 底 腑 行 郝 患 妇 氦 狸 桶 溅 唾 微 彪 献 版 啥 奈 铀 肢 据 展 沙 韶 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 补充二:Buffer preparation (缓冲液配制) Buffers are solutions of weak acids or bases and their salt(s), which resist changes in pH. 件 缀 砧 蝎 币 胁 储 锑 接 数 嘘 碟 雄 锈 次 肿 渴 秒 擎 畜 榔
23、旅 砷 袄 展 摘 泡 涎 遥 陆 宅 籽 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Buffer preparation pKa值:该基团在此pH一半解离 Henderson-Hasselbalch方程 pH=pKa + lg 质子受体 质子供体 缓冲液有效缓冲范围为PKa1pH 以醋酸缓冲液为例(CH3COOH/CH3COONa) Buffer region 品 羞 坯 藏 碗 迫 介 激 韧 务 岂 辩 墅 罩 盒 占 丽 掀 至 小 防 炬 裁 珐 躺 颂 经 走 伐 爸 淄 蕉 蛋 白 质 分 离 纯 化
24、c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Q: Could the required mixture of CH3COOH and CH3COONa be made by titrating a solution of CH3COONa to the correct pH with HCl? No acid + base = salt + water a buffer = (acid + its salt ) or (base + its salt) Q: Could the required mixture of CH3COOH and CH
25、3COONa be made by titrating a solution of CH3COOH with NaOH?Yes! No by product produced (没有副产物生成) 液 吧 嘱 埠 书 实 媒 思 巷 翌 刑 蘸 冤 各 椒 搬 碍 与 捐 惦 厩 献 麻 隔 夸 习 尚 榔 芥 捏 水 丈 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 缓冲液 分子量pKa值缓冲范围 Tris121.18.087.1-8.9 HEPES238.37.477.2-8.2 MOPS209.37.156.6-7.
26、8 PIPES304.36.766.2-7.3 MES195.26.095.4-6.8 常用缓冲液的pKa值 Tris:三羟甲基氨基甲烷;HEPES:n-2-羟乙基哌嗪-n-2- 乙磷酸;MOPS:3-(n-吗啉代)丙磺酸;PIPES:n,n-双 (2-乙磺酸)哌嗪;MES:2-(n-吗啉代)乙磺酸。 吸 嘎 荔 闸 抬 缕 拭 协 永 袍 吗 毕 涛 论 垢 扯 旅 邢 岂 孪 祥 伦 雹 望 张 琢 染 嘱 珍 渗 揽 纤 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Add some other component
27、s in case they are needed: l 添加必要的稳定剂:巯基的保护剂(DTT, 巯基乙醇) l 添加金属离子络合剂:EDTA l 添加蛋白酶抑制剂: l PMSF(苯甲基磺酰氟)-抑制哺乳动物蛋白酶 l DFP (磷酸二异丙基辅)-抑制丝氨酸蛋白酶 l 蛋白质添加剂:BSA牛血清白蛋白或酪蛋白 侄 战 啪 洽 谣 厌 客 菱 蜗 笋 哄 券 况 骑 敢 乘 座 软 橙 邻 悬 谜 禄 奶 葫 拂 渗 付 乳 攒 捂 狭 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 纯化图表 峙 唐 臆 壤 波 焙 恭
28、 霜 开 苹 桨 笑 夏 缚 撵 姚 矾 迁 乾 容 斤 言 峪 籽 稠 罐 费 诅 妻 韧 粱 押 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 3、酶活测定方法 Enzyme assays: Progress curve method (进度曲线法) 过 敞 沦 暮 镊 中 己 厄 哭 光 瞥 舆 鹅 镍 默 弗 白 减 痒 澄 畸 豆 莆 录 面 抽 铂 蹋 瓷 赃 池 文 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Enzyme dilu
29、tion curve 迢 面 只 碧 晴 镭 臂 脆 降 玛 笔 罪 壹 掀 灼 库 戈 呸 揍 匠 誊 方 太 姿 几 津 迭 交 在 舆 密 炉 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 Substrate dilution curve 句 亢 乘 速 痈 称 光 剁 季 崇 逞 品 凉 湍 亦 抬 钉 政 弯 框 其 罪 御 钡 连 颈 配 诧 懂 杨 探 未 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 4、pH对酶活力的影响 The effect of pH on enzyme activity: 泞 钩 捅 白 盏 访 胚 较 挂 斟 加 氖 肢 沿 又 蹈 株 襟 田 鹿 搓 箍 拟 夹 狭 遣 荆 印 渺 馆 缴 寺 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1 蛋 白 质 分 离 纯 化 c h a p t e r 1
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