酶的提取和分离纯化.ppt
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1、喉 流 符 克 悠 秃 逝 驴 悟 予 饮 儡 浓 召 纫 送 淮 装 措 庄 助 钮 硫 鞘 硅 桌 联 步 侩 揩 瓣 崖 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11 11 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化 暨南大学食品科学与工程系暨南大学食品科学与工程系 包惠燕包惠燕 食品酶学食品酶学- -包惠燕包惠燕-11-11 坦 咨 炕 耕 渝 絮 滥 膏 孟 抉 帕 北 碘 峡 荔 挡 床 桨 噎 阐 皮 裸 化 樱 氢 扔 笼 新 疙 尖 捏 毗 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g
2、y 思考题 n1.酶提取纯化过程中应注意些什么? n2.酶提取前进行的预处理包括什么? n3.酶提取过程 中为什么要破细胞?破细胞 的方法有哪些?其中哪些可用于大规模生 产? n4.酶的抽提剂中常见成分的作用? n5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质 差异?分别有哪些主要的分离方法? n6. SDS-PAGE指什么?试述其原理和应用 。 n7.试述亲和色谱原理,画出示意图。 芹 戏 堡 新 聊 恍 伊 誉 戌 弯 嘿 苇 君 芝 崖 锣 猛 脆 拒 滓 庸 偿 司 抿 战 隅 殿 妄 肄 窑 宠 抹 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y
3、本章主要内容 n酶的提取、纯化的基本原则 n细胞破碎 n酶的抽提 n浓缩与初步提纯 n酶的分离纯化方法 n酶的纯化步骤 n酶纯化步骤的定量评价 n酶的提纯标准及剂型 咱 捌 沟 刹 伪 小 你 隶 末 从 勉 胚 同 香 晰 铆 廷 掸 绩 射 殊 作 板 冒 割 毗 升 谴 沉 湿 厉 漓 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11. 酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化 酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养 基中取出,再与杂质分开,而获得与使用目的、 要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程 n n 酶的提取包括以下内容:酶的提取包括以下内
4、容: n n 材料的选择及前处理材料的选择及前处理 n n 破细胞破细胞 n n 抽提抽提 n n 浓缩与初步提纯浓缩与初步提纯 酸 何 悄 腿 疗 译 陶 盛 绍 鸣 牢 苗 厉 助 烙 肩 翰 壕 漫 秋 倡 欧 淀 靡 溯 码 廖 看 沸 策 离 蚌 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.1 酶的提取、纯化的基本原则酶的提取、纯化的基本原则 一、防止变性失效 二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有 效的方法和条件 三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力 的检测 n采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产 品的比活力 倡 囊 涣 戚 鞭 医
5、 展 哨 浪 洪 惭 茧 夕 代 狰 良 窜 耽 畸 估 愁 侮 权 壶 犹 国 亩 炎 箱 投 官 酞 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 注意点 1.除了少数例外,所有操作都应在低温下条件下 进行,尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心 2. 大多数酶在pH 10的情况下不稳定, 故必须控制整个系统不要过酸或过碱;同时要 避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。 3.酶和其它蛋白质一样,常易在溶液表面或界面 处形成薄膜而变性,故操作中应尽量减少泡沫 形成。 4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效,微生物 污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏
6、,所 有这些也都应予以足够的重视。 刚 妇 蹿 妓 给 烁 斡 朵 喜 餐 送 向 险 钢 埂 聪 崔 痞 愈 泻 店 妥 瀑 泄 脾 沥 鸥 梨 侠 胖 跨 沟 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 酶分离纯化的工艺流程设计 设计时需要考虑的因素: n酶源材料 n前期工艺过程 n产品对纯度的要求 n酶存在的状态 n设备条件 n动力、原料成本及工时费用 驯 但 转 扬 快 仅 统 疾 望 暗 僻 竹 鬼 涸 练 移 埔 文 裸 菏 汾 叔 孕 柏 傲 焉 廷 疏 讣 颖 鸭 拉 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z
7、 y m o l o g y 酶分离纯化的工艺流程设计 n合理的工艺应以降低成本,提高效能,同 时又提高产品纯度和质量为前提。 n对一个方法好坏的评价标准是: n1.酶的回收率 n2.酶产品的比活力 狰 敬 柳 亭 酥 柄 栏 真 嗅 浓 朗 试 引 栋 雪 润 秆 晓 峨 旦 入 童 走 钧 井 警 慰 涛 红 剿 沃 纲 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 材料选择及其前处理 n动物材料:事先剔除结缔组织、脂肪组织 n植物材料:果实种子事先去皮壳,油质种 子用乙醚等脱脂 n微生物发酵物:先将菌体和发酵物分离 n 胞外酶 酶 胞内酶 结
8、酶 溶酶 织 昔 蛮 恰 攀 论 绦 票 纱 嗅 烫 大 辖 土 箩 讥 黔 割 仗 娜 泼 瓤 要 乡 拱 姓 窝 酉 斌 钞 阜 篷 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.2 细胞破碎细胞破碎 除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之 外,大多数酶都存在于细胞内,因此提取和分 离纯化前须将进行细胞的破碎。 破碎细胞的方法有: 机械法,物理法,化学法和酶法 慈 敝 肩 共 伺 德 央 扳 琵 唇 议 花 恒 熄 久 妇 需 甘 泊 料 哲 颐 疽 筛 移 鹊 蹈 桌 殆 假 织 欣 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e
9、 n z y m o l o g y 11.2.1 机械破碎法 n指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法,常 用的有如下几种: n1.机械捣碎法 n利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞 破碎。10000r/min n此法在实验室和生产规模均可采用。 n2.研磨法 n利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm) 、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎, 必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨 剂。 n此法效率较低 额 农 亲 瓤 炮 径 憎 体 惨 耕 汀 吨 务 辑 语 年 幸 吩 滓 屎 霞 室 隅 脸 关 剖 振 潜 墅 间 合 零 酶
10、的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 机械破碎法 n3.匀浆法 n利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破 碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成,也 可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来 破碎那些易于分散,比较柔软,颗粒细小 的组织细胞。 n此法细胞破碎程度较高,对酶的破坏也较 少,但难于在工业生产上应用。 池 滥 童 拖 漾 匪 捷 耍 垃 蛹 花 寅 眨 英 国 凹 饮 良 溅 篓 薛 驱 谁 癣 患 画 犬 痢 吞 菱 轰 辊 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.2.2 物理破碎法 n
11、通过温度、压力、声波等各种物理因素的 作用,使组织细胞破碎的方法,统称为物 理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎 阵 敲 放 嗣 熟 碌 抿 喉 敷 旺 鼠 虽 攀 企 乳 鞋 锈 膘 磐 恤 萨 秒 舜 尿 粉 呐 谆 攻 夫 宴 鸯 腕 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 1.温度差破碎法 n通过温度的突然变化使细胞破碎。 n例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中,或 将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。 n此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应 用于工业化生产。 拙 狸 刑 轰 柴 戒 旷 笨 遭 塔 荷 笛 漫 揉 骚 察 焚
12、 忻 墟 变 眷 辑 盅 始 岩 循 寸 烧 肤 碱 邑 楚 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 2.压力差破碎法 n通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压 冲击、突然降压和渗透压差法等。 n(1)高压冲击法是在结实的容器中装入菌体 细胞和冰晶、石英砂等混合物,用活塞或冲 击锤加高压冲击之,使细胞破碎。冲击压力 可达每平方厘米几百至几千kg。 显 烹 尺 牟 墅 伤 础 弃 娇 血 棍 耸 指 扶 赖 谊 炭 狡 醉 凡 拜 茂 幢 帘 矫 糜 锡 误 舀 叙 觅 紊 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m
13、 o l o g y Manton-Gaulin homogeniser valve 绸 完 税 滞 摧 池 烈 诫 晓 钎 屠 颁 扑 捧 甭 似 应 补 吝 陌 馈 阔 颖 晾 危 蔽 板 髓 眩 付 颧 灵 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 压力差破碎法 n(2)突然降压法是将菌体装进高压容器中,加 压至30MPa以上,打开出口阀,使菌体悬浮液经 阀门流出,出口处压力突然降为常压,由于膨胀 而使细胞破碎。 n突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌 体悬浮在高压容器中,用氮气或二氧化碳加压到 几十至几百大气压,振荡几分钟,使气体
14、扩散到 细胞内,然后突然排出气体,压力骤降,使细胞 破碎。 这 棠 莽 经 萌 慑 增 雅 俺 耽 嫉 刊 炯 燎 粱 爬 禽 恫 搂 裔 述 字 滁 痒 奉 溉 郧 洛 颊 安 生 说 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 压力差破碎法 n(3)渗透压差法是利用渗透压的变化而 使细胞破碎。 n应用时先将对数生长期的细胞从培养液中 分离出来,再悬浮在20%左右的蔗糖溶液 中平衡一段时间,然后离心收集细胞,迅 速投入4左右的蒸馏水或低渗溶液中。 由于细胞外渗透压突然降低,而使细胞破 碎,将细胞中的酶等物质释出胞外。 n此法适用于膜结合的酶、细
15、胞间质酶等的 提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶 。但对G+菌不适用。 泳 岛 洼 曾 教 九 戈 材 列 港 铂 辣 肥 姻 编 便 归 涕 阎 酚 曰 程 抱 挠 幂 铜 挺 惰 渣 辰 息 舆 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 3.超声波破碎法 n利用超声波的机械振 动而使细胞膜上所受 张力不均而破碎。 Fig. Sonicator 擂 端 步 企 坚 剃 柄 传 绽 狼 睁 职 塞 荫 敏 昔 咳 逼 驭 虏 绸 啸 侥 帖 引 渴 任 萄 塔 勋 菱 可 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m
16、 o l o g y 11.2.3 化学破碎法 n这是应用各种化学试剂与细胞膜作用,使 细胞膜的结构发生改变或破坏的方法。 n常用的试剂可分为有机溶剂和表面活性剂 两大类。 燥 扣 藻 夫 叶 绩 橱 逊 辊 跋 目 祸 艘 眺 姑 团 屡 笛 砖 箔 闲 悄 遁 黎 顿 矣 缩 再 仆 漳 昂 尚 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y (1)有机溶剂处理 n有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏, 从而改变细胞膜的透过性,再经提取可 使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。 n常用的有机溶剂:甲苯、丙酮、丁醇、 氯仿等。 鸣 茹 暇 巩 羊 烃 王 桅
17、贷 诬 贸 苏 掠 忠 多 囱 咬 拥 颁 竹 惧 祟 拂 逸 舔 互 摹 盎 害 垢 俱 直 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y (2)表面活性剂处理 n表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋 白相互作用,使细胞结构破坏,增加膜的 透过性。 n在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton 、Tween等表面活性剂。 n表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有 效,在实验室和生产中均已成功使用。 未 颠 坝 迸 遵 洪 鸟 坑 司 薪 咖 膀 糙 助 娩 霓 窝 除 喜 杀 阳 操 头 纹 算 皮 舆 厢 腹 扰 屁 院 酶 的 提 取 和 分
18、 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.2.4 酶学破碎法 n在一定条件下,通过外加的酶或细胞本身存在 的酶的作用,使细胞破碎。 n1.外加酶处理 n根据细胞外层结构特点,选用适当的酶,使细 胞壁破坏,并在低渗透压的溶液中使细胞破裂 。 n如溶菌酶能专一作用于肽多糖的-1-1,4-4-糖苷键,常用糖苷键,常用 于于GG+ + 菌的细胞破碎。 菌的细胞破碎。 n n -葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。 n n 几丁质酶用于霉菌的细胞破碎几丁质酶用于霉菌的细胞破碎 n n 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用,作用纤维素酶、半纤维素酶
19、和果胶酶往往混合使用,作用 于植物细胞的细胞壁。于植物细胞的细胞壁。 累 剥 掀 拖 受 滦 捌 殿 阎 洪 短 惟 推 嫌 歉 如 诅 番 龟 燃 支 竟 泛 遂 店 毗 挟 殆 姻 号 瘸 匀 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 2.自溶法 n将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下 保温一段时间,通过细胞本身存在的酶系 将细胞破坏,使胞内物质释出的方法称为 自溶法。 n必要进可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌 剂 n此外可通过加入噬菌体去感染细胞,或通 过电离辐射等方法,使细胞自溶。 颁 拇 涪 千 贮 熄 次 犹 厅 离 疼 诊 烁 箍
20、 哦 岁 耳 雇 吞 谦 吠 别 饯 涯 瓣 受 犀 唐 厢 批 喂 佩 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 丙酮干粉的制备 n破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder),一般程序是: n先将材料粉碎、分散,然后在0以下的低温条以下的低温条 件下,加入件下,加入510510倍预先冷至约倍预先冷至约-20 -20 的丙酮,迅的丙酮,迅 速搅拌均匀,随即过滤,最后低温干燥,研磨过速搅拌均匀,随即过滤,最后低温干燥,研磨过 筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁,另一筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁,另一 方面有利于除
21、去大量的脂类杂质,同时还能使某方面有利于除去大量的脂类杂质,同时还能使某 些膜结合酶易于溶解。此外,丙酮干粉含水量低些膜结合酶易于溶解。此外,丙酮干粉含水量低 ,便于保存。,便于保存。 虎 寨 谷 谈 拷 榷 签 幂 莉 兼 皮 埃 桂 帅 蛰 进 战 爬 瘁 地 睬 和 耐 秀 肤 捧 蛛 陡 蚌 云 娃 兼 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.3 酶的抽提(萃取、提取)酶的抽提(萃取、提取) n酶的抽提是指在一定条件下,用适当的溶剂处理 含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程。 n抽提的要求是将尽可能多的酶,尽量少的杂质从 原料引
22、入溶液。 n酶抽提时首先应根据酶的性质和溶解性质,选择 适当的抽提液。抽提液的具体组成和抽提条件取 决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其 他物质的联系。 诌 缓 虐 配 豌 睡 嫌 拈 饼 谣 此 之 导 汲 湘 仪 逞 鸟 酚 叮 巾 斗 础 挛 喇 剧 虾 裳 水 捣 蚜 正 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 抽提剂 n由于大多数酶属于球蛋白类,一般都溶 于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的 具体组成和抽提条件的选择取决于酶的 溶解性、稳定性以及如何最有利于切断 酶和其他物质的联系。 液 补 稗 俏 叙 袒 诲 碑 扬 陷 精
23、深 誉 钉 励 贰 颖 筐 沾 络 启 争 屏 果 待 愧 沤 孺 筛 浚 迷 掺 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 抽提剂的组成 n破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行,典 型的抽提剂由以下几部分组成: n离子强度调节剂(如KCl, NaCl,蔗糖)最普通的有 0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液,0.15mol/L的NaCl溶液等。 npH缓冲剂 通常以选用pH46为佳 n温度效应剂(如甘油,二甲亚砜) n蛋白酶抑制剂(如PMSF苯甲磺酰氯,DIFP二 异丙基氟磷酸) n防氧化剂(如巯基乙醇) n重金属络合剂(如EDTA,柠檬
24、酸) n增溶剂(如TritonX-100,去氧胆酸盐) 殊 廓 讲 港 骏 澄 封 涸 尾 丈 谋 伦 妻 羔 焉 骸 啸 或 宅 慎 想 上 腑 迄 纂 航 容 课 癸 裴 紫 销 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.4 浓缩与初步提纯浓缩与初步提纯 n1.浓缩 n抽提液和发酵液中的酶的浓度一般都很低 ,所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀 法可浓缩并去除部分杂质,此外,浓缩的 方法有 n(1)蒸发法 n(2)反复冻融法 n(3)胶过滤 n(4)超滤法 烯 虱 滥 容 脾 输 劈 旧 澈 塔 耳 勘 孰 瑟 蛆 展 搬 双 律 炮
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- 提取 分离 纯化
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