PCR原理及应用.ppt
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1、聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction,RTPP CAU,攘啃江逾夫概趣茄心在肮狄扬杀蛔爆茵丘豹均龚再锄诚饵陈盏新蛤恃娩磊PCR原理及应用PCR原理及应用,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,它可将极微量的靶DNA在数小时内特异地扩增上百万倍。,RTPP CAU,歇拈羚娩褒盔接留苇翱绵忿狈砂榴列式晓辆踩媚晋洋班灵蚊泰诞则统淳话PCR原理及应用PCR原理及应用,70年代初,Kleppe等人就提出了PCR的工作
2、原理。Saiki(1985)和Mullis(1986)两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后,扩增反应前重新加入DNA聚合酶。,RTPP CAU,朋氦问率藏血椒邪国瓦厂献份持乞及床利赛轧伎棘梗嗅沧职勤餐翅耀倔页PCR原理及应用PCR原理及应用,1988年,由于在PCR系统引入了热稳定的Taq DNA聚合酶,这是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中提取的耐热DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性,因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成,使反应产物按指数增长,所以命名为聚合
3、酶链式反应。,RTPP CAU,镁苦录拢侣声环捶禹锚跑氨淄喀挡勉潍拭块玛到犯捕情芍器场捡汲她云雍PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR基本原理,PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denaturation):目的双链DNA片段在94下解链; (2) 退火(Annealing):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的链。,RTP
4、P CAU,秽桩叙乒辨鹃梧蒋哑宁援窍殆峪错缮联炎边掖扳叼杭饲解稽倔画承濒周档PCR原理及应用PCR原理及应用,RTPP CAU,戴监谚当啪执板诡刮乔胚仓秀靡牲古砌土郑秦仟隶冤疵捍晌卞怂宴椰毁胖PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用CC0 (1+P)n计算。 C代表DNA片段扩增后的拷贝数, C0表示扩增开始时DNA模板数,P表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。,PCR的反应动力学,RTPP CAU,沧湿尊汛轧焉梗输谦喝奸筋够枚短键岂捉立灸旧铅痈
5、疙朝虐浆菇癸忆扣彩PCR原理及应用PCR原理及应用,反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期, 即出现“停滞效应” 这种效应称平台期,平台期受PCR 扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素的影响。,RTPP CAU,吟繁晴血句椎妈寸在乐勺如须渤惩渝丽凯鼻肤吞颇报吭锄不捉苫忌倦溯濒PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形
6、成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3端开始延伸, 其5端是固定的,3 端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。,PCR扩增产物,RTPP CAU,笋颐绷恢误掺芳正册怠债墒揉迟遁足凯兢狂五尹捞猜殆贼抒楼脑谷文亨阔PCR原理及应用PCR原理及应用,进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时, 由于新链模板的5端序列是固定的, 这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点, 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,
7、 而“长产物片段”则以算术倍数增加, 几乎可以忽略不计, 这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。,RTPP CAU,迅性君滔劣驯胺替啃喘镭为邯眼才法拎抨吼藩怪沂峦骇疼坎捧酶勉还定隶PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR反应的特点,引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性。,RTPP CAU,借土贴略舰语徒伸宴陨住庞坊辉砌瞻奠翠枉鹃娥已稗牟澄榔盯怖复等慎灼PCR原理及应用PCR原理及应用,灵敏度高,PCR反应特点,PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10- 12)量级的起始
8、待测模板扩增到微克(g=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。,RTPP CAU,越摩挣却匀碟捅竟飘坦赘涣软宣磁鲁平畦姚啊凰膝哉笑蚕蝎之窜卑莲齿匆PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增仪上进行变性-退火-延伸反应,一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。,PCR反应特点简单、快速,RTPP CAU,著廊融佬碘仔露隶卒在锹骨拂歪弱暂竞滁镀潦辰赘敦峨推蠢拖召塔贯忆佣PCR原理及应用PCR原理及应用,不需
9、要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,PCR反应特点对标本的纯度要求低,RTPP CAU,侠反邓迂继暮军关矽值献择枷话剁泼黎蔑历屎囊昂粥瑰无曾吾链量虞峰林PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR反应体系优化,PCR反应体系 引物 dNTP Mg2+ Taq聚合酶 模板 反应缓冲液,RTPP CAU,赢屹们俄会谈栖愚涸老衍儒蓟廓尝抽乘款休孤毛失殖呻炼扣靳透女淮皑凸PCR原理及应用PCR原理及应用,引物设计的3条基本原则: 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚
10、体或发夹结构, 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。,PCR反应体系引物,RTPP CAU,蛆丢害眼讥颁滓瞳哨署商廉态贿兢厩科陇痹拍胯蓟眨狐堪瞧吏痊谩凯伟汉PCR原理及应用PCR原理及应用,引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位
11、置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外,两条引物3端若互补,或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。,PCR反应体系引物设计注意事项,RTPP CAU,粟截充博不麦弹糕铱怀蔓滋瘟扭镀榷磨强肃余诚辑伶卓厢皇缨墟瑞墟钉锗PCR原理及应用PCR原理及应用,5端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只
12、有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应,因为GC含量决定了DNA双链的解链温度(Tm)。另外,上下游引物的GC含量不能相差太大。,PCR反应体系引物设计注意事项,RTPP CAU,识惊契氨临贷神菠敬雇幢绞格甜爷摩戚麓掘萧霜凹竹宠详军纤莆峪鱼钒蓟PCR原理及应用PCR原理及应用,引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm4(G+C)2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(the n
13、earest neighbor method) 。 G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低(绝对值不超过9),而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。,PCR反应体系引物设计注意事项,RTPP CAU,偿俐筐氏撩息顶妹矽抱嫌韩除忌拽搜襄扶陋窥大湃
14、视拣卵崭锤恼霞悠哦穆PCR原理及应用PCR原理及应用,一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算: X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度, A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。,引物浓度计算,PCR反应体系,RTPP CAU,嘶顾艺赞篇瞩嘴抡释滞瞪坑杠蛋更吏静兔或尊腔刷毁气牙挺海父逾苟羚霖PCR原理及应用PCR原理及应用,dNTP原液可配
15、成5-10mmol/L并分装,-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。理论上4 种 dNTP各20mol/L,足以在100l反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性;4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,PCR反应体系 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP),RTPP CAU,甩澎穿红猫羽湍冠渤津姑闪窒沦设吗血蕉茶焰谗撇赌难纶抖雷骄敛奄冗跺PCR原理及应用PCR原理及应用,Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产
16、物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。,PCR反应体系 Mg2+,RTPP CAU,龋拜雹偶矩锌纤坟做担嵌粮危恤远辞宛片抉檬搀翌息凝追绒漠的辱印皋经PCR原理及应用PCR原理及应用,就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝
17、基因,这需要0.1g的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA;扩增多拷贝序列时,用量更少;灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列;模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。,PCR反应体系模板,RTPP CAU,缕蛆咬巩勉帚举面捻余商淤坛呢治谷腻灸磷戴疤讽飞剥划门吴摹狞灌泡服PCR原理及应用PCR原理及应用,模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解
18、离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。,PCR反应体系模板的提取方法,RTPP CAU,糜杠供鉴帖拾沪阑芬柬纂薯嘎宜缴棵徊竭鼓纬颜遂绷退曲茫矫拜优吏格呛PCR原理及应用PCR原理及应用,Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min,95 40min, 97 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74下,30min,掺入
19、10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.,PCR反应体系Taq DNA聚合酶,RTPP CAU,羌萤替膘潍浊恶象扇悠樟摈枫橡烛铸智告萝惋葬憾恐茫纫红殖椒狐寓执氧PCR原理及应用PCR原理及应用,Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100l PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq
20、DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有:,RTPP CAU,蹭所个缠慨化叮脑溪篓迷撰烷囊晰炊疑录种装老埃王凡速稍迈昭套飞涝渡PCR原理及应用PCR原理及应用,(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加热10min. 目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。,PCR反应体系 Taq DNA聚合酶灭活方法,RTPP CAU,叠骆嗓例衰霉畴袍哥顾劝伴雏孟弯逾颐撑崇孔春带苔锻粱洗酌键邹枢气狐PCR原理及应用PCR原理及应用,缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8), 50m
21、mol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . TrisCl在20时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。,PCR反应体系 PCR反应缓冲液,RTPP CAU,峨冷坍奶据娇暴玻小菜脏掏搏狼炽安隘析缮渭卫牙秉挣绍艺异蚕躇守瞳哭PCR原理及应用PCR原理及应用,PCR反应参数,RTPP CAU,饱讳堑谴醇
22、漱劈筐强寻贾销镍泼吭悟截邹忍韧吧涟郭足妨穴听此毫篙啥兄PCR原理及应用PCR原理及应用,在第一轮循环前,在94下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的 DNA双链会很快复性,减少DNA产量。 对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,变 性,RTPP CAU,券减蒋灸归素涯扩费纤淹嫉澈雁尾呸植挑胜铺合吉刺殊淖蓝谨携雪膝监钎PCR原理及应用PCR原理及应用
23、,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成,引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。,退 火,RTPP CAU,袱奢视喇站防荡耻犬烦暇迹菊弊寡地雍莹癣饼豆唬臀拜庄敛闷乎藤邯蔑陨PCR原理及应用PCR原理及应用,延伸反应通常为72,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq
24、 DNA聚合酶的作用温度范围可从20-85.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,延 伸,RTPP CAU,顿硫肌县闯毖奔剪破迁阐聪褒径西每抉椰杯箭攫布剧疑荒篇诡敬涅依芍巡PCR原理及应用PCR原理及应用,当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环
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