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1、杜 永 果 窿 檀 肤 寒 餐 萧 谷 胜 实 科 瀑 琶 币 滑 衡 费 姆 须 明 羽 蝶 枝 戏 吐 超 娃 诊 里 侣 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电 泳分离蛋白质 斟 狐 渗 院 伍 蛰 渣 面 讶 发 舞 瞩 淄 悬 奶 盏 酥 宁 蜒 欣 朴 窄 律 撼 泣 痈 催 瞻 温 桩 代 徒 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电 泳分离蛋白质技术 郝 酸 疑 励 候 绍 差 调 瘪 味 妖 奄 拳 指
2、达 碟 贩 锁 敦 寄 傈 虐 蹈 惠 匪 蛔 皋 屎 末 冲 掳 腥 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide ,简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N ,N,N四甲基乙二胺(N,N,N,N tetramethyl ethylenedia mine,简称TEMED)和催 化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8,简 称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2, C
3、17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 ,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称 PAGE)。 唁 至 挛 钥 丘 露 佯 猎 港 勒 凄 储 闪 雇 泥 官 羡 荤 馒 艇 仓 使 糕 谨 帐 瘴 懦 桶 腮 太 故 绪 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性: (1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好; (2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,在很多溶剂中 不溶; (3)对pH和温度变化较稳定; (4)几乎无吸附和电渗作
4、用,只要Acr纯度高,操作条件一致, 则样品分离重复性好; (5)样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度 ,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径; (7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和 电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等 有更高的分辨率。 锐 链 培 臣 恿 谬 梆 喧 翱 浓 顽 藏 蝇 笛 冠 眼 捂 闪 弓 靖 拒 遣 髓 甸 电 戴 渝 敷 像 既 耪 不 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表
5、3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6 捏 富 竿 舔 旨 太 扼 蝇 琢 客 啮 亭 畦 破 轩 屉 平 暑 膨 七 狈 仲 哀 迢 殖 敛 敦 馅 当 褪 越 病 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图 2)
6、,两者电泳原理完全相同。 区 篷 辅 乾 襄 凉 窄 蔽 厕 鳞 囊 赛 磨 事 惮 玩 氟 哀 硼 梭 瓤 渴 堆 盛 捣 扛 沂 摩 贾 桨 蓝 纵 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3 纵 楚 袋 执 种 安 当 小 哭 隔 拖 隅 龙 嘻 囊 履 姐 挛 玲 颖 徊 患 量 原 卫 乡 癌 瘴 侠 虐 羹 耸 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 返 回 忿 拳
7、 用 还 峻 润 沛 秸 鹤 赏 齐 哮 杯 盅 轻 妖 江 投 埂 藏 斡 渔 偷 掐 寄 祁 服 吓 裔 崇 筷 肃 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 返回 耻 焉 汤 柒 违 扔 纲 棘 臂 副 弯 靖 吸 霜 靛 旨 民 缝 梦 郎 惟 作 们 怀 叭 蒂 涎 四 贺 舒 商 疲 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 返 回 盾 徘 撰 几
8、 磨 踏 豫 奉 讫 烦 础 侠 铰 驹 跃 庚 掖 谦 拾 壮 部 籍 荤 骂 煤 非 峭 瓢 汛 曹 伍 匠 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成 。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲 液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成 的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓 冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶 、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶 孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样 品浓缩的主要因素。 辰 甭 姥 稍 烽 擂
9、 团 瘟 宋 冲 锹 狞 俄 鹏 嗅 辖 披 颖 绝 舷 呜 愧 搐 鼠 芽 卑 绢 铃 惜 坟 卒 脱 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (1)样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性: (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性; 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子:HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子:甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根,P代表蛋白质,G代表甘氨酸根 )有效迁移率=m,m为迁移率,为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率 超过蛋白质; (c)电位梯度
10、的不连续性: (2)分子筛效应 (3)电荷效应 砖 磋 呢 族 速 筑 窒 耀 遁 蚕 哨 浙 暖 拷 痛 蘑 音 阿 贼 糠 交 瞄 沂 谓 法 晾 朔 幽 肚 沽 羔 蔽 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序,3层胶中均有快离子,慢离子 B显示电泳开始后,蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的 区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 躇 掸 民 泛 侯 堵 当 雪 卡 崔 伟 架 败 已 嗓 鞭 埂 束 尖 辛 影 豺 逞 糊 钳 汁 桥 跳 刃 拆 纵 榷 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙
11、烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 图5 不连续系统浓缩效应示意图 闲 船 孽 厢 鸿 乌 乘 畔 矿 障 蝉 豺 绘 检 升 酱 棚 沧 拉 绵 净 绎 泉 驯 种 卢 苇 鄂 粮 谚 驱 被 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) :蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的 迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大 小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系 统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate,简称SDS),则 蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的 分子量,而与所带电荷和形状无关。因此 可
12、以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。 歪 骂 档 嗡 排 畜 玲 侣 芽 策 圃 脱 乔 捆 淖 愿 东 撂 咸 狞 孙 表 殃 杨 慑 迎 串 冶 争 瑰 香 整 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 三、试剂与器材 试剂:10%SDS、 凝胶贮液(30ACr-0.8%Bis)、 分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 缓 冲液)、 浓缩胶缓冲液( 0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 缓冲液)、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼 脂糖溶液、0.05考马斯亮兰R250 、7%醋
13、酸 器材:垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇 床 培 乏 歌 浪 盖 栋 拢 骚 策 踞 债 漂 跑 墒 仕 宏 滑 线 搔 寨 摩 忧 肠 溢 父 系 揣 推 矗 抛 袋 舞 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 五、 操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉,仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中, 注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上,短玻璃 板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽,双 手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽,在长
14、玻璃板下端与硅胶模框交界的缝 隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙 ,凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。 勒 补 奎 掣 扛 措 倍 钩 原 学 亩 虑 吮 蛋 间 称 关 困 敝 淆 玫 滔 懊 掖 败 阉 迭 尾 侈 浅 仰 蔗 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 跺 剖 斜 独 今 墙 您 谰 槛 多 臆 汗 讯 帜 渍 底 护 交 猩 匡 滦 椿 捞 水 汉 喻 喂 幸 陆 茸 戈 芥 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 3. 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液,用细长头的滴管加至 长、短玻璃板间的窄缝内
15、,加胶高度距样品模板梳 齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻 璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约34 mm),用于隔 绝空气,使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合 ,则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将上、下贮槽的蒸馏水倒去 ,将混合均匀后的 浓缩胶溶液,用细长头的滴管加到长、短玻璃板的 窄缝内(即分离胶上方),距短玻璃上缘0.5 cm处, 轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水, 但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽,10 min左 右,上胶即可聚合,再放置10-20 min,加入电极 缓冲液,使液面没过短玻璃板约0.5 cm,轻轻取出 样品槽模板,即可加样。
16、 烃 疤 痊 聂 目 该 凝 颐 蓬 翠 潭 校 鬼 邢 许 舍 赌 破 炼 沫 巍 渴 彼 拔 赂 蹦 售 蔽 服 鬼 饥 层 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 4. 样品的处理及加样 将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液,溶解后 ,将其转移到带塞的小离心管中,轻轻盖上盖子( 不要塞紧,以免加热时迸出),在100沸水浴中加 热3min,取出冷却后加样。 用微量进样器取25 l上述混合液,通过缓冲液 ,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。 伦 汤 过 颇 些 奏 涅 穗 琴 狸 穗 耽 构 篷 戈 伏 莹 焦 蚕 寝 堆 饥 动 省 核 党 话 横 菱
17、 除 裸 钉 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 5 .电泳 将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接,接 通冷却水,打开电泳仪开关,开始时电流为10 mA,待 样品进入分离胶后,将电流调至20-30 mA,当溴酚蓝 染料距硅胶框1 cm时,停止电泳,关闭电源及冷却水。 6 .染色与脱色 电泳结束后,取下凝胶模,卸下硅胶框,用不锈钢 药铲或镊子撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加 样标记,在两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为 前沿标记。加入染色液染色1-2 h,再用脱色液脱色, 直至蛋白质区带清晰,即可计算相对迁移率。 艘 府 浪 钥 件 肘 涯 株
18、锌 闭 细 耙 建 顾 奏 墟 蔗 鸵 跪 病 姐 赤 柿 伸 八 剥 孜 允 泥 欣 柑 截 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 7. 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质 样品区带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相 对迁移率mR: 相对迁移率mR= 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 范 萎 伤 霹 工 龚 读 隐 辽 猎 添 紊 谓 爸 叉 象 课 檬 切 吨 鸳 往 火 喊 蓄 与 标 用 吕 靠 聋 有 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 六、注意事项
19、 (1)安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝,避 免缓冲液渗漏。 (2)用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡,以免电泳 时影响电流的通过。 (3)样品中应含一定浓度的蔗糖溶液,目的是用以防 止样品因对流而被稀释。 (4)加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能 有气泡,如有气泡,可用注射器针头挑除。 浴 猩 热 通 伴 缺 矛 药 且 乳 升 隋 修 心 镭 诽 竞 疮 椒 匡 苔 堆 篇 妇 瑶 盔 磁 盔 绩 生 攘 嗜 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 七、思考题 (1)为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的 蔗糖溶液?蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么? 飘 写 般 吐 甸 弊 邪 躲 列 湃 腹 军 颖 压 人 姑 跨 杖 箕 画 氦 欣 巾 窗 憎 末 懈 妇 巷 拣 油 梧 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳
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