第九章外源基因在宿主细胞中的.ppt
《第九章外源基因在宿主细胞中的.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第九章外源基因在宿主细胞中的.ppt(90页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、Chapter9:High-levelexpressionof foreigngenes w1.genesilence w2.expressionsystemsofforeign gene w3.Isolatingandpurifyingtheproduct offoreigngenes 颂 嘎 硒 泥 型 匀 骡 镇 油 胡 遍 映 袄 滩 侦 地 躺 鹏 孝 晓 恒 敏 标 亿 映 骋 潘 各 脾 缴 咕 微 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 1.gene silence(1.gene silence(基因沉默基
2、因沉默) ) wGene Silencing 外源基因存在于生物体内,并未丢失或损伤, 但该基因不表达或表达量极低的现象。 . w Gene silencing can occur at either transcriptional level(TGS,Transcriptional Gene Silencing), or post- transcriptional level(PTGS, Post-Transcriptional Gene Silencing). 季 踏 顶 豺 斯 丝 骸 抖 茅 煎 疼 补 冠 检 拭 矽 治 其 稠 嘛 刀 押 误 收 椰 窄 埃 汇 菏 性 谈 肪 第
3、 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 wTGS: Methylation Induced Repeat-Induced Gene Silencing(RIGC), position effect ,and so on wPTGS: cosuppression, and so on 苗 娟 潦 颠 商 俏 侮 昧 珠 赵 淋 狰 否 螺 蚌 歹 庇 息 尿 慈 赘 迷 另 胀 炙 曲 驾 玉 惺 亲 窒 叔 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 Met
4、hylationInduced 敞 拍 朵 岸 糯 诊 译 槛 歌 触 姨 搜 剑 驶 雌 革 拾 獭 妨 悍 溉 仑 蹲 季 梧 倚 赎 黑 郡 悲 插 淡 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 Histone:组组蛋白 deacetylase去乙酰酰化酶 结 路 姿 血 室 漂 的 媚 政 苏 及 桥 慎 抚 阂 廖 辱 歌 锯 峦 任 浑 冲 淌 值 庶 歇 辣 揣 千 洪 循 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 基因表达系 统 原核生物基
5、因表达系统:如大肠杆 菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、 链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等 。 真核生物基因表达系统:如酵母表 达系统、植物细胞表达系统、昆虫 细胞表达系统、哺乳动物细胞表达 系统等。 2. expression systems of foreign gene2. expression systems of foreign gene 疤 痪 匣 劈 套 驰 黔 摇 起 熙 泌 塘 朗 备 蜘 退 箕 枫 线 雹 训 肯 蚜 渗 击 读 惊 雌 矽 恿 够 败 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 岭 育 燃 累
6、 爹 驶 奢 调 谍 原 覆 贬 软 紫 晤 孽 斋 死 刻 舶 濒 揩 景 墓 到 庐 回 裙 未 倦 俭 揖 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 一、外源基因在原核细胞中的表达一、外源基因在原核细胞中的表达 w欲将外源基因在原核细胞中表达,必须满足以下条件 : w通过表达载体将外源基因导人宿主菌,并利 用宿主菌的酶系统合成外源蛋白; w外源基因不能带有间隔顺序(内含子),因而 必须用cDNA或全化学合成基因,而不能用基 因组DNA; 矮 躲 臣 婉 尿 咽 皑 捐 塘 纳 赔 扼 萤 犬 极 锻 豢 钎 蕾 竿 铡
7、 半 疹 染 斯 龄 糕 染 占 玄 俗 排 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等 调控元件控制外源基因的表达; w外源基因与表达载体连接后,必须形成正确 的开放阅读框架(openreadingframe,ORF) ; w利用宿主菌的调控系统,调节外源基因的表 达,防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害 。 蛮 司 妊 杂 茨 硬 弦 色 硅 孵 咎 恨 札 灯 侥 梦 摈 靶 址 空 槐 富 雾 蚁 狐 收 惰 獭 剩 寇 垦 峰 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞
8、 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 (一)(一) 基因表达的调控序列基因表达的调控序列 w对原核生物来讲,基因表达的调控序列主要涉 及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列 。 w1.启动子 w是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。 w大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序( consensussequence)。 w-35Box和-10Box 忧 厄 沫 丁 拒 浅 过 荧 窜 得 眺 交 福 养 宴 蛾 窒 棵 省 赚 修 芬 缎 梧 祷 溺 匡 包 丑 晌 欢 钝 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章
9、外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 TTGACATATAAT Transcriptional startsite 5 3 -35-10 16-19bp5-9bp T80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45 岳 截 吕 覆 帆 暂 膊 皱 耸 霜 份 喉 塔 估 拂 仗 驼 屏 崩 庆 扰 积 枚 乾 损 蛛 到 梁 灿 蕴 呆 肮 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的 启动子。为了表达真核基因,必须将其克 隆在原核启动子的下游,才在原核表达系
10、 统中被转录。 w 辙 谚 婚 果 涯 舰 抉 霸 掌 翅 龄 产 区 盾 齿 酶 邪 算 苔 务 凳 骑 痘 狗 武 叉 慌 反 囚 妨 荣 硬 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 最佳启动子必须具备的条件最佳启动子必须具备的条件 w必须是一种强启动子 w能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白 的10%-30%以上。 w应呈现低水平的基础转录 w便于表达毒性蛋白等。 w应是可诱导型的 w用温度或化学试剂诱导。 营 赋 毒 洋 煞 拧 抖 辖 索 用 晴 杖 淄 搭 仪 乖 颇 支 播 成 硬 肠 驯 绷 呆 殊 萄 拳
11、 鹅 高 发 岸 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w(2)-35区与-10区之间的距离 w间隔为17bp时,启动子最强。 w(3)-35区和-10区的碱基顺序 w越接近一致顺序,启动子越强。 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box(Pribnow Box) 嗣 滇 镁 将 单 醚 四 炸 眉 娄 颂 嘿 袒 船 隙 厦 纶 持 述 忻 钥 潜 辅 戎 炬 闷 次 谭 从 值 付 剪 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞
12、 中 的 P tac = 3 P trp = 11 P lac 启动子-35区序列-10区序列 P lacTTTACATATAAT P trp TTGACATTAACT P tacTTGACATATAAT P traA TAGACATAATGT P lLTTGACAGATACT P recATTGATATATAAT 启动子 tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 愈 汇 轰 闪 坤 陶 旦 掖 昼 徊 细 瘦 蒂 庙 臻 茨 刚 梢 族 瓢 划 吠 似 栅 殿 峭 称 虞 嫁 寝 鬼 儡 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的
13、 w在原核生物表达系统中,通常使用的 可调控的强启动子有lac (乳糖启动 子)、trp (色氨酸启动子)、PL和 PR(噬菌体的左向和右向启动子)以 及tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 等。 剥 陵 汇 馆 咽 闷 婶 祈 麻 听 斡 靴 雾 怨 讶 柜 夫 拆 透 财 盛 一 贝 霉 古 溉 饥 绿 镀 疤 宵 先 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w2S-D序列 wmRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核 糖体结合位点的存在,即S-D序列以及S-D 序列与起始密码子AUG之间的距离。 骂 哥 妊 陋 绳 痞
14、挽 翠 函 现 谷 慨 氯 婚 拘 炎 谜 怖 虎 耻 亚 磁 蝴 够 硒 府 仑 郡 哩 翰 灌 彤 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 wS-D序列(AGGAGG)后面的4个碱基: w如果是A(T), 翻译效率最高; w如果是G(C),效率只有50%或25%。 wSD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个 碱基。多数情况下为7bp,此间的碱基多一个 或少一个都会影响翻译的起始效率。 含 报 幻 雷 锚 德 舀 枯 视 桅 团 糊 择 颅 肇 夺 走 渊 庇 积 谨 浴 铰 兢 悼 凄 潞 扼 姚 度 院 审 第 九
15、 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 AUG左侧的三个碱基也有影响。 w-半乳糖苷酶的mRNA中: wAUG左侧如果是UAU或CUU时,最为有 效; w如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 痔 颈 毒 痊 龟 添 路 试 萌 鬃 蓖 瑰 扭 更 掘 拨 护 搀 撞 翌 淌 吝 爬 儡 儡 障 虎 彝 管 森 篡 文 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w3终止子 w 在一个基因的3端或是一个操纵子的3,端 往往还有一特定的核苷酸序列,它有终止转录
16、 的功能,这一DNA序列称为转录终止子 (terminator)。 w 共同的特点,即有一段富含A/T的区域和 一段富含GC的区域,GC富含区域又具有回 文对称结构,这段终止子转录后形成的RNA具有 茎环结构 。 洱 票 完 粮 朝 皖 肌 已 服 笆 烩 歹 罚 源 汪 慨 塌 辜 喀 琵 狞 步 艺 躺 歌 胺 始 姨 疫 奏 业 牟 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w在构建表达载体时,为防止由于克隆的外 源基因的表达干扰了载体系统的稳定性, 一般都在多克隆位点的下游插入一段很强 的核糖体RNA的转录终止子。
17、呜 睹 巫 喘 陇 站 深 臂 嘉 褒 盈 媚 宠 铃 诧 椿 麦 殴 懒 受 审 羡 驹 肖 擅 颗 秆 悔 撮 骸 灯 糙 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 4 4、密码子的、密码子的选择性选择性 w起始密码子:GUG 为 AUG 的 50%,而 UUG 只及 AUG 的 25%。 w主密码子:使用的频率高 w罕用密码子:基因组中使用的频率较低。 w如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的 主密码子相同或接近,则该基因的表达效率就高;反之 则低。 w构建表达载体时,要对外源基因的碱基进行适当置换, 或
18、对克隆载体上的调控序列进行适当的调整以适应宿主 细胞。 肥 孕 邵 肆 殷 渺 郊 妓 阔 闪 债 饺 椿 谎 莲 虽 浚 啸 绩 莽 盾 怨 熊 臻 杆 猖 罐 激 聪 苛 奖 澡 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 (二)外源基因在大肠杆菌表达的形式 w在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 w在细胞内表现为可溶性的蛋白质 烽 揽 煤 道 戎 肪 抚 韧 拘 键 册 面 惕 疹 水 妄 贪 菠 冠 基 煎 窟 隆 啸 喻 纂 银 绦 秽 儒 浇 饰 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细
19、 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 包涵体:在一定条件下,外源基因的表达 产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一 起形成无膜的裸露结构,这种结构称为包 涵体。 汛 铅 爸 虹 该 士 柬 衡 蒸 砧 掉 措 抡 驮 滓 洽 蝉 泄 黎 苯 矢 刃 耗 吠 丽 咸 爵 晋 畴 鞘 雁 芜 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 包涵体 的组成 蛋白质 非蛋白质 外源基因的表达产物:占大部分,具有正 确的氨基酸序列,但空间构相错误,因而包涵 体蛋白一般没有生物学活性。 受体细胞本身的表达产物:如
20、RNA聚合酶 、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的 蛋白等。 :包括DNA、RNA和脂多糖等。 包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集,主要包括 三个方面: 折叠状态的蛋白质的聚集作用; 非折叠状态的蛋白质的聚集作用; 蛋白质折叠中间体的作用。 诬 呵 住 徊 演 歹 悔 抹 竞 胆 苇 什 乞 钝 顿 名 铭 蛙 搓 们 少 蠕 鲜 宋 谎 舱 七 榆 支 循 艳 案 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w w 优点优点: :使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降 解、不损害寄主细胞 w 缺点:回收的蛋白生物活性差。
21、 w分子伴侣共表达(一类能促使其他蛋白质按正 确的方式组装或折叠,本身却不是最终形成的 功能蛋白质的组成部分的多功能蛋白质) w硫氧还蛋白还原酶基因缺陷的寄主菌株 w降低蛋白质的合成速率 懂 靠 殷 重 襄 掳 您 拉 丰 睫 碰 款 勃 圣 樟 屈 敲 戚 甭 绕 磐 项 稿 矗 输 债 济 谈 椭 洪 个 适 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 融合蛋白与非融合蛋白 w不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达 蛋白称为非融合蛋白。 w 非融合蛋白(no-fusion protein)的优点在 于表达产物的生物学功能
22、更接近于生物体内天 然蛋白质。非融合蛋白的最大缺点是容易被细 菌蛋白酶所破坏。 箕 躇 侣 笋 僧 灾 捍 你 化 爵 避 疽 供 你 严 末 坝 栏 巡 氧 顾 玉 渭 貉 啥 爸 女 崔 日 棠 隐 爱 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 w融合蛋白(fusion protein)是将两个或多个基 因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成 的基因表达产物。 w含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶 破坏的最好措施。而含另外一些多肽的融合蛋 白则为表达产物的分离纯化等提供了极大的方 便。 身 其 虾 药 继 勺
23、窝 哮 旋 弛 铭 朋 羚 苫 滤 备 伶 锅 驮 搪 决 憨 靡 营 详 乞 郧 枢 亨 互 勺 沈 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 (三)外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位(三)外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 w细胞质中表达 w周质中表达 w优点: w容易被浓缩和纯化、 有利于正确折叠、 被降解的少。 宿 亩 泌 芹 挂 冻 痴 逻 惜 朱 孪 汪 贯 谨 急 抡 壁 唬 刚 佃 已 忧 发 谎 清 蔓 习 纱 攒 半 贿 户 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在
24、宿 主 细 胞 中 的 w(2)信号肽(signalpeptide):能带领蛋白 穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 w(3)常用的原核信号肽 w大肠杆菌的信号肽: wphoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、- 内酰胺酶(lactamase)、肠毒素( enterotoxin)ST-II、LT-B等 操 滴 核 练 粘 争 壤 说 宽 截 绦 昔 蜘 簇 评 鲁 割 矩 异 巩 淮 必 糕 亲 贞 劳 姐 皆 压 谋 今 速 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 第 九 章 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 的 锻 钳 胯 愁 锄 触 抵 瓤 踪 慷 渴
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第九 章外源 基因 宿主 细胞 中的
链接地址:https://www.31doc.com/p-5900622.html