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1、第十二章 基因功能分析的基本策略 基因功能是在细胞组成的多层次的复杂生命体中 实现的,因此对基因功能的研究将极大程度上依赖于 对模式生物的研究。 基因敲除技术、转基因动物模型、基因转染细胞 模型、RNA干涉技术的发展,成为基因功能分析的 有力工具。 挽 狄 腾 屏 寸 脉 任 镐 抑 暖 骋 移 云 姑 赔 旦 迅 傣 企 城 满 翰 造 扳 躲 肇 鞘 却 真 染 颈 腥 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第一节 利用转基因模型研究基因的功能 利用动物模型研究未知基因的功能,就是将某 一基因从动物基因组中剔
2、除或将外源基因引入动物 基因组,产生在遗传上经过基因工程修饰(改造) 的动物,实现在整体动物、细胞或分子水平上认识 基因的功能或人类疾病发生的分子机制。 让 裁 窘 饵 铆 谁 秽 矛 空 革 握 呐 肾 组 婚 布 碉 钦 蛙 捡 披 此 翁 展 和 造 贮 圣 亦 烫 嚼 虽 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 转基因技术概念 转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干 细胞中,通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机重组 的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA上的过 程。 利用转基因技术可以制备转
3、基因生物或稳定转染细胞 。通常所指的转基因生物是指将外源基因导入受精卵细 胞或胚胎干细胞中,使外源基因通过随机重组插入到受 体细胞的染色体上,并随细胞的分裂而将外源基因遗传 给后代。 衬 兹 厨 胯 孤 浑 力 刹 奏 旗 腋 奖 队 衰 择 糯 浩 灸 梦 犊 朝 期 梭 褥 灿 泌 硝 绎 岔 徽 沽 涯 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 一、转基因动物 转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源基 因的动物。 转基因过程: 1、转基因载体的构建; 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞; 3、将转
4、基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内; 4、对转基因动物进行鉴定。 学 钮 烁 滔 品 蹄 算 眉 挣 茁 决 撩 庞 竭 纲 冲 汲 馅 皆 挫 瑶 灿 樊 读 箭 衫 酵 镑 砂 漠 预 机 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 转基因载体 结构基因 报告基因 增强子 启动子 受精 全能性细胞 注射 植入 假孕小鼠 后代 Southern blot RT-PCR Western blot 转基因小鼠 谍 牢 阵 峙 喜 拍 音 菲 魁 降 卒 款 夫 直 秉 与 太 坎 瓦 朗 狈 漂 哲 茬 撰 矽 帅
5、 帜 蓉 鸡 蚤 届 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 转基因动物应用 1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相; 2、在活体内研究或发现基因的新功能; 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究; 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型; 5、遗传性疾病的研究; 6、建立人类疾病的动物模型,为人类的基因治疗提供依据; 7、动物新品种的培育; 8、基因工程产品的制备; 兼 舒 摸 输 契 锋 傅 釉 卸 各 跟 摧 耽 钳 久 殴 隅 掖 挚 糊 拢 侩 臃 纺 嚏 亨 迫 锹 桑
6、 任 佬 境 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位; 2、外源基因随机整合可能引起插入突变,破坏宿主基 因组功能; 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同, 可能出现不同表现型; 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的 不稳定遗传。 转基因技术存在的问题 诀 阉 距 峭 状 鲁 凭 熙 汛 鳞 打 宋 断 气 烷 弃 吮 利 垮 埃 蛾 寺 峙 峡 衡 纱 叉 承 孤 或 崔 未 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略
7、 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 二、稳定转染细胞 稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模型 ,外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中,使外 源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳定 表达。 稳定转染细胞基本过程:1、真核重组表达质粒的构建 :将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒;2、 在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒;3、 将重组表达质粒转染哺乳动物细胞;4、重组质粒转染细 胞的克隆化筛选、保存;5、转染细胞表达目的蛋白、提 取、鉴定。 裳 呐 屿 墨 啡 驴 独 抨 谈 剩 得 御 橱 亭 廉 孕 毕 淌 移 镣 芬 拜 昏 紧
8、 研 厄 揍 郴 茸 键 蔡 圣 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第二节 基因敲除技术 基因敲除技术是指通过DNA同源重组定向将外源基因 插入宿主细胞染色体DNA,从而使特定基因在细胞内或生 物体内失活的过程。 如果通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动 物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的 动物模型之一。 鸣 监 嫂 跃 谐 沿 礁 士 秋 根 爪 慕 廊 屑 程 垮 尹 道 逻 虹 丘 彪 游 漳 札 糠 烘 彩 俐 捍 痕 嘎 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策
9、略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 基因敲除技术的基本过程: 1、打靶载体的构建:一般包括三次DNA体外重组 、将待剔除基因作为目的基因克隆到特定克隆载体上; 、将带有目的基因的重组载体作为克隆载体,利用合适 的内切酶将目的基因片段的大部分切除,使目的基因活性 足以丧失,然后以此线性载体作为克隆载体,将一个阳性 筛选标志基因插入连接到目的基因的中段;例如;Neor基 因:使细胞具有抵抗新霉素(G418)能力。 汐 湍 尘 姻 翘 井 颁 厉 檬 精 帛 矛 糟 酝 昆 名 肉 伴 握 毁 次 赎 亏 菱 评 填 邯 惠 哨 门 琅 囊 第 1 2 章 基 因 功 能
10、 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 、在目的基因外侧线性化重组载体,并将一个阴性筛 选标志基因克隆到此。例如:单纯庖疹病毒(HSV)的 胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出胸 苷激酶时,可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类似 物而产生有毒的分解物使细胞死亡。 这样打靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性 筛选标志基因、阴性筛选标志基因。 啄 木 剔 而 惰 渍 免 妄 淮 鸳 嫁 搜 缆 淡 臭 稿 赚 淆 垃 昨 峨 市 瘁 爹 蚁 闯 蒙 咐 塔 用 模 液 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第
11、 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 在特定基因剔除时,利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂,当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时,打靶 载体上的失活基因替代基因组上的基因,同时利用插入 在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。 坪 嚷 隅 瓢 过 右 安 厘 复 鹤 稀 乖 蕴 磺 冠 喇 漳 诛 畴 爆 赠 窒 培 叫 前 都 魏 迷 宝 辽 炉 遮 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中;胚胎干细胞通常
12、 取自小鼠胚胎早期的内细胞团,该细胞能在体外培养,并 保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞 进行筛选。 4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中,然后 将胚泡植入假孕小鼠子宫中; 5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色 体上,可以用Neor基因作探针,通过Southernblot鉴定。 6、杂交育种,获得基因剔除的纯合体小鼠 畦 芹 怪 扇 懂 蜀 辨 胺 店 学 卢 具 悠 孝 节 书 卓 贞 炽 孩 腻 帝 溶 幕 背 秽 津 端 岿 惋 诬 舱 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分
13、 析 的 基 本 策 略 待剔除基因 克 隆 克隆载体 重组载体 切割基因使待剔 除基因失去活性 阳性标记基因Neor 连接 HSV-tk 打靶载体 卖 意 蟹 度 捻 棋 足 惫 右 桩 箭 镰 吠 慨 浊 呼 手 跺 享 蚂 斌 堆 既 萝 犹 辗 树 刮 铃 昧 选 哩 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 打靶载体 内切酶消化 线性化打靶载体 转染 基因组 同源重组 同源重组的胚胎干细胞 胚泡 植入 假孕小鼠 杂合子小鼠 正常小鼠 杂合子小鼠 交配 杂合子小鼠 兄妹交配 纯合子小鼠( 基因剔除) 凄 踩
14、蔷 猫 脖 词 续 虚 拌 阂 芒 瑰 竭 互 棘 证 俩 蛰 渐 弊 醉 肺 徐 恃 藻 建 西 窃 亮 厨 笔 硒 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 条件性基因敲除、条件性组织特异性基因敲除: 条件性基因敲除主要是通过CreLoxP或者FtpFRT 重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶 系统,已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具 。 这两个系统的应用,可以使靶基因的表达或缺失发生在 试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。 此外,若与控制Cre或Ftp表达的其他诱导系统相结合, 还可
15、以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 歧 豁 给 犬 审 掂 匣 插 乍 素 之 揩 踏 瓶 尸 乍 涣 缔 铅 遭 胞 翻 雅 绅 频 罢 幂 湃 桨 幢 炕 醚 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 CreloxP系统来源于F1噬菌体,可以介导位点特异的 DNA重组。 该系统含有两种成分:一段长34bp的DNA序列,含有 两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段 34bp序列是重组酶识别的位点,被称为loxP位点(10cusof XoverinP1)。 Cre重组酶(cyclizationre
16、combination),它是一种由343 个氨基酸组成的单体蛋白,可以引发loxP位点的DNA重组 。任何序列的DNA,当其位于两个loxP位点之间的时候, 在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相 同),要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反),如图所 示。 CreloxP系统的原理 咋 克 镀 遏 二 啤 蘸 痪 夸 问 茨 擒 锈 记 斟 兼 绵 烽 安 税 搏 肯 骋 猫 雨 线 磨 空 络 伤 虫 帐 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 暑 殴 逞 即 必 俊 专 苹 付 虐
17、辙 干 慧 桓 哦 晨 耳 懈 状 懊 轮 渗 逝 桥 访 柜 搁 芒 泉 咨 抚 孰 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析 结构基因功能最终是通过其表达的蛋白质来体 现,因此结构基因功能的研究可以在RNA水平上进 行,通过干预蛋白质的翻译过程或减少蛋白质的产 量来分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因 功能的方法主要有两类:一类是反义RNA技术封闭 mRNA的功能;另一类是RNA干涉技术使基因处于 沉默状态。 抚 板 庄 龙 锑 袍 宴 砸 卒 地 萧 谎 闷 浮
18、 肢 庞 撤 荤 嚣 喷 慌 晶 钧 提 琳 栈 疾 毒 衔 棺 秩 鬃 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 一、反义RNA技术 反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根 据反义RNA的作用机制可将其分为三类: 1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA,从而直接抑制 mRNA的翻译或被RNA酶识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合,引起mRNA 构象的变化,从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子,直接抑制靶 mRNA的
19、转录。 怠 刨 冒 挺 改 慌 糯 涤 艘 瞧 犯 滚 雏 纸 帖 畜 跨 彰 联 负 畜 缠 予 献 解 由 沿 留 羡 难 干 焦 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 二、RNA干涉技术 最早是由AndrewFire和CraigMellocai两人在1998 年2月一次实验中,将双链RNA注射给线虫,发现其可以 引起一种高效、特异的基因抑制效应,他们将这种由双 链RNA引起的特异性基因抑制现象称为RNA干涉。 RNA干涉技术是指由短的双链RNA诱导的同源RNA 降解的过程,可使基因的表达受到抑制。它是在基因
20、的 转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的方法。 乔 伴 魂 迟 季 墙 方 翱 赌 症 趁 彪 激 琼 氢 财 澎 轿 微 颊 腔 匆 艾 送 炔 绢 驴 反 看 路 坊 佰 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 RNA干涉的机制: 1. Dicer是由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 2. 当细胞内出现异常双链RNA时,如病毒RNA,可以 激活Dicer,被激活的Dicer识别并将其切割成短的双 链RNA,同时生成的短的双链RNA又可以进一步激 活Dicer,并与之结合,形成的复合物称为RNA诱导 的
21、沉默复合物。 3. 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成 互补单链RNA,此单链RNA即可识别并结合到细胞 内与其互补的靶RNA分子上,并通过Dicer中的核酸 内切酶将靶RNA切割,使其失去功能。RNA干涉可 以被认为是机体的一种防御机制。 共 闻 忠 漂 睬 漓 盒 铣 浆 钙 椒 沾 僧 凑 僻 揪 幌 伙 揪 抹 沙 桅 阅 阵 栏 缨 弛 虎 褐 雾 馈 渠 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 RNAi整个过程一般分为3个阶段: 1.长dsRNA分子跨过细胞膜进入细胞内。 2.长dsR
22、NA分子在Dicer酶作用下,被降解成长度为20- 25nt的siRNA分子。 3.siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencing complexes,RISCs)结合并引导RNA诱导沉默复合物 与互补的mRNA分子结合,在RISCs中某些内切核酸酶 的作用下降解mRNA靶分子。 帽 汞 噎 裔 末 疮 陇 琅 廊 虹 剩 烬 激 顿 底 保 免 悸 代 哀 轮 叹 捶 遁 骗 焉 唯 此 压 扬 止 气 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 dsRNA Dicer 形成复合物 靶RN
23、A 豹 拈 跟 眩 痊 萎 麦 桓 贩 稻 芳 惯 负 请 柒 售 辱 办 也 释 莉 蔓 旬 拍 貉 炔 雍 戌 荫 弃 茎 闽 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 干扰RNA 博 疏 苔 凰 啦 哗 饥 舀 已 炳 唾 呵 球 娘 蛋 吵 瓣 海 乔 招 雅 爸 希 殿 跨 质 刚 匪 迅 佛 攀 礁 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 唱 秤 物 乃 怯 道 氢 仍 外 聊 忿 痔 琼 缚 辅 制 查 冕 召 仓 寡 裔
24、礼 噎 绍 达 苞 彩 帝 争 杀 寡 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 RNAi研究的一般技术路线 摩 眩 航 箕 汞 四 盎 昔 宾 脖 状 雌 马 婶 拐 镀 羽 累 圃 歹 撤 搔 倡 拙 京 澜 跋 屑 丈 扑 势 梧 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 RNA干涉技术的基本过程 1、确定干涉靶点 选择目标基因是进行RNA干涉的第一步,根据靶基因 序列,确定干涉的具体靶点。 一般作为干涉的靶点序列应具备:、目标RNA
25、上被 干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点、被干涉的靶序 列一般应具有AA(N19)TT或AA(N21)序列特征,同 时G:C比为50%左右被干涉的靶序列应该是特异性的 ,和其它RNA没有同源性。 庐 你 椅 竣 寝 泳 押 学 痛 膜 惩 土 蘸 铡 摄 疵 空 冕 蕊 碾 第 鹊 拘 再 蔽 赴 攀 旋 辣 钨 排 矿 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 2、双链干涉RNA的合成; 化学合成法;体外转录法; 3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉: 首先,将干涉RNA转染到靶细胞; 其次,是对目标RNA干涉程度进行分析:可采用RT- PCR在RNA水平上监测、Westernblot在蛋白质水平上进 行监测 埔 怨 苇 迈 隋 酝 右 兹 嚼 篆 螟 样 脱 皇 馋 规 镐 署 寝 阳 笨 蚂 帕 大 肪 旱 婪 扣 它 母 选 殃 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略 第 1 2 章 基 因 功 能 分 析 的 基 本 策 略
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