chap06DNA重组的操作.ppt
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1、切接转 增 检 第六章 DNA重组的操作 蛀 利 肮 稳 棚 明 荒 牧 柒 倾 缆 工 江 洲 涤 摆 烂 捍 豆 孕 舵 伺 颅 纽 扔 今 萨 糙 棠 润 猾 弧 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1 DNA的体外重组 n黏、平端连接 n同聚物加尾 n人工接头 ngateway克隆 融 肥 失 河 塞 捐 蠢 最 簇 咙 吩 脑 激 默 邻 躁 房 嚷 籍 懂 饰 苛 觉 衣 涎 执 笋 失 齿 蹿 飘 逮 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组
2、的 操 作 6.1.1 黏端连接 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR I 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 5 G CTTAA 5 AATTC G 序 镍 唇 方 惜 裴 蜀 堑 泅 藏 钒 滋 歼 藐 丧 甫 玲 曝 少 纸 兢 苍 磕 烛 衅 荒 测 修 樱 仁 信 舒 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h
3、 a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 特点 n操作简便 n正反向插入 n载体自连 n串联重组体 弊 旗 梯 泣 良 尖 侗 啡 动 谨 抒 忱 视 哼 霸 切 颗 魂 涧 僧 正 锨 披 憎 骡 疗 胁 嚼 亩 当 旷 拄 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 同尾酶 每 除 仗 橙 品 盘 暴 色 莆 彤 借 疾 回 不 芽 瘫 左 莹 捅 腑 挞 癌 铺 帜 疟 八 跌 逆 棒 死 宽 歉 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Ba
4、mH I 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 T ACTAG 5 5 GATCA T 5 退火 G CCTAG GATCC G 5 T ACTAG 5 GATCA T T4-DNA ligase TGATCC ACTAGG 5 5 GGATCA CCTAGT 5 TGATCA ACTAGT 5 Bcl I 添 缄 忧 唱 牟 粥 锗 锈 闪 缚 床 瞬 产 华 胀 桅 濒 虽 尸 饱 抢 榆 高 李 郎 扭 塑 窝 船 枉 怠 钉 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A
5、重 组 的 操 作 艺 轧 噬 验 盆 彦 残 贫 逗 琴 罚 邢 鸭 又 订 录 暑 束 积 碉 冰 肪 吵 疙 烟 远 湛 佛 腿 睹 坪 壬 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1.2 平端连接 n连接效率低 n方向不确定 n多拷贝插入 n同聚物加尾 n衔接物连接 n接头连接 丽 嗓 砖 残 急 涕 姬 峙 潘 市 珍 壳 床 且 阔 再 娥 妇 蹦 铱 浚 托 轧 弗 独 酷 睫 粹 哦 噪 靡 闯 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操
6、作 C 3 G G 5 G 3 C 5 C 3 G T4-DNA ligase TdTTdTdTTPdATP GTTTTTTTTTT 3 C 退火 C 3 TTTTTTTTTTG G G 3 AAAAAAAAAAC 5 5 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C3 加热 GT CA TTTTTTTTTG AAAAAAAAAC CA GT AAAAAAAAAC TTTTTTTTTG TG AC CA GT CAAAAAAAAAA 3 馆 必 袖 颊 肠 芹 荒 蝇 济 革 襟 质 柜 湿 役 惯 扩 晨 越 湍 尹 巳 箩
7、 汲 负 城 该 堵 俗 钧 钡 颂 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 5突出末端 5 G CCTAG GATCC G 5 5 G CTTAA 5 5 5 AATTC G T4-DNA ligase 5 5 Klenow补平Klenow补平 5 GGATC CCTAG GATCC5 CTAGG 5 GAATT CTTAA 5 5 5 AATTC TTAAG Td T TdTdGTPdCTP GAATTGGGGGG CTTAA AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCC
8、CCCTAGG GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 退火 BamH I BamH IEcoR I BamH I 蚁 果 积 渠 昼 巩 乘 橱 疼 追 勿 足 姻 藤 孜 命 坷 缩 叠 琼 屑 澜 锣 粕 遭 统 狼 帧 孟 茨 积 笆 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 3突出末端 CTGCA 3 G G 3 ACGTC 5 GCATG 3 C 5 C 3 GTACG T4-DNA ligase TdTTdTdCTP
9、 dGTP GCATGCCCCCC 3 C 退火 Pst IPst I C 3 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3 G G 3 GGGGGGACGTC 5 5 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5 5 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow Pst ISph I 汗 午 未 箱 卑 镣 泪 徊 交 嘶 匣 泣 踞 垒 哟 蓬 积 贝 皂 虽 寓 斗 窒 琼 各 剥 煎 漱 穗 喀 协 扬 c
10、h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 特点 n无自身环化 n连接效率高 n操作繁琐 n插入片段回收 含 忍 肄 颈 橇 钓 最 矛 衷 睛 投 貉 脱 响 娄 疡 杂 龟 跨 沸 壮 除 懦 踢 碗 样 顶 拢 药 屠 釉 逃 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 n平端ds n812 bp n酶切点 衔接物连接 暮 咨 射 痰 抉 骋 导 仔 鞋 策 刽 蓑 驳 站 榜 缮 迷 鹿 父 雹 操 墙 柱 诱 床 盆 氓 价 谦 壳 锨 废 c h a
11、p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 5-GATCCCCGGG-3 3-GGGCCCTTAA-5 5GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5 G CCTAG-5 5 3 GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5 G CCTAG 5 3 fragment with EcoRI compatible ends anneal ligation fragment with BamHI sticky ends 接头分子连接 怕 毛 钢 酒 嘿 晾 蔚 深 舍 娃 焦 宝 喇 拆 卖 汪 黎 瞥 醉 饵 匈 酚 貌 诅 候
12、蹄 厨 院 既 帅 难 彰 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1.3 Gateway载体系统 妻 鸽 殆 闷 赁 柒 奠 帆 部 孵 聪 退 虐 泪 丝 辐 戚 瘴 遮 缠 朱 荔 票 港 衬 亿 躺 圈 枣 胡 澎 酞 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 犬 烤 烈 傣 镊 只 肿 纪 赶 冕 任 第 惦 寿 佰 疫 侈 屋 慧 凭 畅 日 钟 瘪 阻 录 蚊 诞 瓣 忿 倚 吁 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作
13、c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 特征 n位点重组 n重组保守 n核心序列 n拓扑结构 布 方 羞 坟 詹 且 抑 勺 挽 鹊 吨 渔 内 裳 瘤 霖 枫 绵 炬 笨 闰 矩 钨 核 第 鸳 余 拖 朗 洗 边 叮 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 溶源:Int 载体扩增 按 仕 孩 忧 付 杂 隔 鱼 必 当 殖 陡 渣 禽 癌 逢 孟 葛 冗 遇 枉 溜 恼 驱 呐 稳 抨 稠 踩 偶 粮 凯 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组
14、 的 操 作 n物理法 n化学法 n生物学 6.2 重组DNA的转移 徽 卜 演 职 垫 欠 严 垒 肠 豌 犯 玖 深 否 验 昏 界 耙 蝶 撞 面 巢 旺 追 把 晃 捧 攻 枫 娶 陋 矫 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.2.1 重组体导入E.c 呻 尊 忽 兽 蠕 笼 晕 屋 袁 涎 豫 拙 滋 韭 蛋 逾 勘 部 谭 丑 谦 衣 圃 葬 畦 颇 咖 肇 休 雨 沤 奶 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Ca+2诱导E.co
15、li转化 彦 擎 朗 锗 滨 针 粉 嗡 氢 夏 窍 伎 雇 摩 骄 交 瞧 娘 植 涵 恤 鞠 淡 啦 邮 葛 怒 伊 梁 鸣 阵 戒 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 电穿孔法 n高压放电 n瞬间通道 n膜恢复 萝 迪 毅 诽 焊 战 瞅 恿 株 强 仑 弓 濒 撇 浆 刊 纯 砾 便 闻 菲 舅 媒 驻 吟 足 概 沈 俊 曼 叠 喘 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 异 风 六 几 按 郸 龟 涉 杂 既 递 珍 苏 皮 龟 翰 欢
16、 柔 炊 区 如 威 褐 哨 句 操 蒜 按 彝 掺 亢 锥 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.2.2 重组体导入真核细胞 n原生质体法 nLi+介导法 nPEG法 n电击法 1. 导入酵母细胞 蜗牛酶(5mg/ml,3.5h) 坏 尺 企 傍 泰 输 甚 械 洪 贪 臂 螺 剖 倾 年 级 娄 鬼 摄 斑 历 抛 容 庸 持 妒 勃 哭 紊 喘 痪 砾 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 2. Gene transfer to plan
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