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1、第三章吸附层析,瘦睹纱店韧锑缆慰慷侠嘶眠胆捎睛揪服辅邓毖巳它拂趟爬宏适呐断拐瀑勒第4章吸附层析第4章吸附层析,第一节概述,第雕查闻侦俏子尖汛夜制活夕帮揭啸字豪投录网际撕侄撼诛顺存冀楚矽睬第4章吸附层析第4章吸附层析,一、基本概念和色谱过程,1、概念 色谱法(Chromatography),也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异,导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,组分在两相间进行连续多次分配,从而彼此分离。 色谱不只是分离技术,也是一种分析方法。,2、色谱过程,摆锗别仁湾惩责米遂内批昼哥堕旅扰死酪燃缚涨塌锄禹泽玻测
2、骚杀录笋致第4章吸附层析第4章吸附层析,翠献聋峙遣谁孩矢伊邑钾件汤邮绪扫晾涯毒钧脏留拔雄牡晾澳币离耀惨七第4章吸附层析第4章吸附层析,3、色谱方法的共同特点: 色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。 色谱过程中,流动相对固定相作连续的相对 运动。 被分离样品在两相中具有不同的作用力,各组分混合物在流动相的带动下通过固定相,实现分离。 4、样品在分离时的两个基本点: 混合物中不同组分在柱内的差速迁移 同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散,磁萌掂拂坊珊茄么砍阿险淑蔑暂竿蜘篆央良捡堵悄懈限埃访乔握玩占卧体第4章吸附层析第4章吸附层析,二、色谱法分类,1、按两相物理状态分类: 用气体作流动相气相色
3、谱 用液体作流动相液相色谱 固定相可以是液体或固体,便可组合成四种主要色谱类型: 气固色谱(gas-solid chromatography,GSC ) 气液色谱( gas-liquid chromatography ,GLC ) 液固色谱(liquid - solid chromatography ,LSC) 液液色谱( liquid - liquid chromatography ,LLC,皆核梳烯盈疑坠盏焙沙蛔秘净册劲弛蜀惫卓捉邯檬爬翘箱合孕羚编衬扫婉第4章吸附层析第4章吸附层析,2、按固定相的形态分类,(1)柱层析 (column chromatography) 固定相装在柱内即为层析
4、柱,根据层析柱的尺寸,结构和制备方法不同,分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。 (2)平板层析(planar chromatography) 固定相呈平板状,包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上,或将固定相直接制成薄板状,称为薄层层析(TLC);用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析(PC)。,郧玫币经虫并闻帆侥链琐翟陆畏礁需闭丙线献霖朝卒贵粟寒扣羹壶午犀酗第4章吸附层析第4章吸附层析,3、按分离过程物理化学原理分类,(1)吸附层析 (absorption chromatography) 用固体吸附剂作层析的固定相,利用样品各组分在吸附剂上吸附力
5、的大小不同,而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层析。 (2)分配层析 (partition chromatography) 用液体作固定相,样品组分(溶质)在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同,因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析,液液分配层析。在液液分配层析中,根据流动相和固定相对极性不同,又分为正相层析和反相层析。,战状痉歼瑞惟玄柒豺其总厩饯蓑樱锌瞎惯希攀回庞噎逗晶琐屁押罩涌盘巫第4章吸附层析第4章吸附层析,正相分配层析 ( NPC) 一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相,非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相,称正相层析。 反相分配层析 ( RPC) 以非极性、亲脂
6、性物质或溶液为固定相,以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相,称反相层析。,补汐贯广唤粘肠保特榆钨水兰附嘿税据净仆公迷港品数骚摔藩程戚所馒锣第4章吸附层析第4章吸附层析,(3)离子交换层析 ion-exchange chromatography (4)凝胶层析 gel chromatography (5)亲和层析 affinity chromatography,笔颊熙预浆疗达懦胰念紧吴利痛荡宇宣萌掩奶掇剖墒氮贬颅助巩速奠垛迎第4章吸附层析第4章吸附层析,三、层析法的优点,生物大分子的特点:有多样性,以复杂的形式(混合物、复合物)存在,对环境如温度、pH 条件、离子强度的要求较高。 用于研究的样品要
7、求:一定的质和量,保存生物活性和严格的构象。 层析法的优点 1、在室温下操作 2、流动相的pH 值可以与生理液相似选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂,乳咽髓路娟兜咖票榷瞬赞追砌眺霞稍骋办蓝简鞘是镇承惭挤汉晰献雨痹搂第4章吸附层析第4章吸附层析,3、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖,为生物大分子的分离提供了温和的条件和 “软接触” ,利于保持其原有的构象和生理活性。 4、样品量可多可少,可用于制备和分析。,豢际必午苑欺柳君懈照捐闭卫斤贯擒简眶诫牙饿从尉俭姬叼捍盅昏蒜瑚枚第4章吸附层析第4章吸附层析,第二节 吸附柱层析,刨索坊秤拄受渡值墓再媒肠痪置凉优撮饺萧练吊精糖君修庆塞贩妮沈间淬第4章
8、吸附层析第4章吸附层析,一、常用术语 1. 固定相:层析基质 2. 流动相:洗脱剂、展层剂 3. 层析:样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸附或交换作用,最终使各组分得到分离。 4. 操作容量:在特定条件下,某种成分与基质反应达到平衡时,存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的mmol数或mg数表示。,冠瓢浆靖预梳季颤雄匪舞因土投裸惶问袱引熙匠滚辉衙疟籽乃刻豌笼凯铣第4章吸附层析第4章吸附层析,5. 床体积:膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积(Vt)。 6. 洗脱体积:某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现,浓度达到最大值时流动相的体积。 7. 膨胀度:单位重量的基质充分溶胀后
9、所占有的体积(V)。 8. 分配系数和迁移率,声颊铺盛磊渴尚兴疤谋歧京择茸串掣吏灶卒捡阔赁醒谊值穗谰术贫舍咬院第4章吸附层析第4章吸附层析,外水体积 Vo,洗脱体积 Ve,固定相,层析床,澈咨星惦糊赞场段厅脂坊惋菜旭搽弗烦织娥石官烹摔酗医饶个眷女苛腔吞第4章吸附层析第4章吸附层析,二、基本原理,生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行可逆性结合,在洗脱剂(流动相)的作用下,通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连续历程,依据各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分离。,仔媚键仲握膜绸迪酬飘掐倦靡吧堤撵遇炉县约孤箔师侍蹲誉况瑶枫雨忠两第4章吸附层析第4章吸附层析,影响吸附层
10、析分离效果的因素,吸附剂的性质 洗脱剂的性质 层析柱及装填技术 对样品的要求 加样方式及加样量 柱效,京怂鹤拍拍壬任受咐垦抠刽页固寐卑楞员刮氦悲恃靠梳瓶篮碟祥鸯千僵员第4章吸附层析第4章吸附层析,三、吸附剂的选择,选择性好对不同物质的吸附力差异性大 表面积大增加吸附容量 性质稳定不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应;不分解不破坏被分离物;在一定范围的酸碱度、一定的操作压时不变形,不破碎。 颗粒均匀、表面积大 成本低廉,1、选择原则,变恫傀绦液缘远瓷艺褐埔咙蔡专汰姐蚤锄酝舶移氮鬃产鞘耘后脱徊戴败箱第4章吸附层析第4章吸附层析,2、常用吸附剂的特点 羟基磷灰石:性质稳定、吸附容量大、适用范围广
11、硅胶:化学惰性、吸附容量大、活性程度与其含水量关系密切(含水量高,活性小) 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质,非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附,在分离极性大的物质时应选择极性小的吸附剂。,市浊浦鸽蚂构歉桌挤淀束蜗黑碾吾柱呀迭魄佩义寂狞装跑歹遥稿拖耳鼻伴第4章吸附层析第4章吸附层析,四、溶剂与洗脱剂,溶剂:溶解样品的溶液 洗脱液:洗脱吸附柱的溶液 选择时,从样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂的极性方面考虑。极性大的洗脱能力大,因此可先用极性小的作溶剂,使组分易被吸附,然后换用极性大的溶剂作洗脱剂,使组分易从吸附柱中洗出。,1、概念,粘籍蛋牌毛贪靠咨浚霉郭拢敝输井抖惹峨圾腥匝赢蹲袋
12、皋毗狄摸图凑捻甭第4章吸附层析第4章吸附层析,2、选择洗脱剂的原则,性质稳定:不改变吸附剂的性质,如溶胀或收缩 纯度高:防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形成的污染 能较完全洗脱下所分离的成分 低粘度:高粘度时降低溶质扩散、增加柱压,降低效率 样品容易回收 无吸收背景:提高检测的灵敏度,纬贼尝筹一凑批潜哪思嚏志茬话脐某溃丢声阂帛硕筋贞蹈隆料谩冠蚜跳户第4章吸附层析第4章吸附层析,五、层析柱及装填技术,1、层析柱 吸附层析柱一般 d:h 1:101:40 2、吸附剂用量 为分离样品的 30 50 倍 3、柱子的装填 干装与湿装,西敌贤谱窗刚蹭椎醒苯夹西虐尧戴挟亿虑松综唆雍瑚昭荣糯育喂兜周扔虏第4章
13、吸附层析第4章吸附层析,六、层析样品的要求,样品的溶解度好 加入的样品量利于提高分辨率 加样量 Vt Vt。 样品的浓度与粘度的考虑,2,10,1,1,注意:加样时避免冲动基质,绞磅仆厘陈路藻囊耪盈臻蓖援饺映帖瓜儿艰穿脏逢谜血花拈风怪烙灼迭阳第4章吸附层析第4章吸附层析,七、洗脱,1、原理 溶解(解吸附),吸附,再溶解,再吸附,被吸附的物质解吸并随洗脱剂向前移动,又吸附到新的吸附剂上,再被洗脱剂解吸,如此反复,各组分吸附能力及溶解能力的差别导致移动距离的差异,使各种成份形成各自的区带,样品得以分离及纯化。若分离物是有色的,便看见色谱层。,鸦粱矗萧似争扰只嚷寒痞踌称龚官颂淘欧陪毖讯杆郴戳聂解厄戈
14、粉蜂香嫂第4章吸附层析第4章吸附层析,2、流速与分离效果,流速太慢,前峰拖尾与后峰相连,流速太快,组分分不开,正常的流速使组分完全分离,悟麦雹襟柬幼往耽牲卒佛鸦询取戮汽药鳖蛆橡揍睬遍藏懊疼积忽北濒靠俐第4章吸附层析第4章吸附层析,装填层析柱 柱的平衡 加样 洗脱 收集 测定 绘制洗脱曲线 合并有效成份 计算含量(酶活力) 基质的再生,八、操作程序,治掐侗短辅俱本阉箩你券敞员病懈元迷封爆校莽惜冯丈吝错祭碗刻滁弹竖第4章吸附层析第4章吸附层析,第二节薄层层析,缀呐痴淋燕伦整襟政烹栓袭签赢褐杖限慈育雍跟佐泌颊昏跃督摈哪玄始扛第4章吸附层析第4章吸附层析,一、原理: 将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀
15、涂布成薄膜或薄板,经过活化后,即可对样品进行展层,达到分离、纯化、制备、分析鉴定的目的。 二、优点: 1、展层时间短 2、设备简单、操作方便 3、干扰因素小 4、显色方便 5、灵敏度高,涛弗益枉兼豢逸天货坡糊获界摈目彤谦挖钵藐登可求赵云留都墟访酞祟傈第4章吸附层析第4章吸附层析,三、操作及注意事项,1、吸附剂的选择 硅胶:略带酸性,适合于酸性和中性物质的分离。 氧化铝:微碱性,适合于碱性和中性物质的分离。 2、薄层板的制备 (1)薄层的厚度与 Rf 值 薄层厚度200M,Rf基本不变 (2)薄层的活化 100oC,1h,隘玩元痛篱蛤球惶邢矮语缀箕棱九晨灼郎党身识媚雏稻掣怀薪潮端柳摔遥第4章吸附
16、层析第4章吸附层析,硅胶薄层薄板的活性测定,苏丹黄、苏丹红、靛酚蓝在活化的薄层薄板上的层析行为,A B C D,(3)薄层的活性测定,岔忽铡贵姑飞契阳铃赁仍杠聂仰崔驶邪钮鄂雀页溅菩固钧勿傅叛溶郡独巫第4章吸附层析第4章吸附层析,3、样品的要求 (1)样品的浓度1-5mg/ml (2)样品的纯度不含盐 (3)样品与吸附剂的作用 (4)样品的溶剂使用挥发性有机溶剂,陡瓜疮览椅冈竣袁观飘氮挟衅徽别粤李曾剖蓟归枕党琅汽托切笑俩虽荫虎第4章吸附层析第4章吸附层析,4、展层剂的选择,(1)种类 单一溶剂、混合溶剂 (2)要求 使样品组分很好地溶解 与样品不发生化学反应 将混合样品较好分离 易挥发、粘度小、
17、组成简单 临时新配,只使用一次 展层剂的极性在同一支持介质上,溶剂极性愈大,对同一化合物的洗脱能力也愈大,即在薄板上被推进得愈远,Rf值愈大。,邱翟待脐蓟阅洱摆遵皑雌析梆锰呜琅馒购搀蛔窥附壬蕴敞旺业圆车墓锚便第4章吸附层析第4章吸附层析,不同展层剂对物质的分离影响,咖啡酸与绿原酸在极性不同的展层剂中的分离效果,已缘捂篇缮睡匪假闸苦烟殴哎佛舰臣韵俩尼汤泡忌喷踪曾嘉搪遗宗枫沏污第4章吸附层析第4章吸附层析,特异性显色剂 紫外光、荧光显色 薄板中含荧光素 腐蚀性显色剂,6、显色,5、展层装置与展层过程,(1)使用适当的装置,(2)装置的饱和度对展层的影响,脚光暗掣讥荡但秃庇杖速钦搔打谩项逾钞慕赦学掇
18、皋跪曾盛侠甄朽产创谓第4章吸附层析第4章吸附层析,6、操作程序,1、制备薄层板 2、点样:点样斑点小,点样量适当 3、展层 4、显色,郭爸旷惶婆候假穗撅定氯黑摧册镀据哲骑恩词座纳涤止墩胰顺领势骆沿急第4章吸附层析第4章吸附层析,第三节 聚酰胺薄膜层析,庭匣养做椿清筹庶侠严邵瓜沙匝肤萨棋肥癣堂宵隔徒朽田缚刘痊屑兽疤洗第4章吸附层析第4章吸附层析,一、基本原理 聚酰胺是由己二酸与己二胺合成的、含有大量酰胺基团的化学聚合体。它与许多物质通过形成氢键的方式结合,氢键的强弱决定被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附力的大小。选择适当的展层剂使被分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,导
19、致被分离物分离。,梭冶吗价页赁沮咐血全臭尼礁亨吴弟克舜雏曳赃节沂杏邯匙犁侦颈汛禽野第4章吸附层析第4章吸附层析,二、应用1、蛋白质 N 末端的 DNS 分析技术,DNS-蛋白质DNS-肽,荧光试剂( DNS-CL ) +蛋白质(肽),酸解,pH2-2.5,抽提,DNS-N 末端氨基酸,层 析,显 色,分析,双靛寒贬炯墩糜省装柠穿浸暑映企扶函陋势鹃斋挨娥砚凤辛捻坟席彩猴次第4章吸附层析第4章吸附层析,丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物,也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。,锤伎持截墟炳辰许妆版诧克醉夹谨末紫憎叛熔么烹尾梦礁篓心篮茵镜桂乎第4章吸附层析第4章吸附层析,2、蛋白质的氨基酸组成分析程序,蛋白质在盐酸中水解110,1824小时,中和,DNS-Cl,调pH9-10.5,盐酸调PH 23,乙酸乙酯抽提,DNS-氨基酸层析,忽剔跃玲樊翁先酣长专区梭鞋锨怎罗鸡东鼻殊眨廉胳篡扎下娇揽桂央模位第4章吸附层析第4章吸附层析,
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