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1、实验五实验五 植物总植物总DNADNA的提取的提取 坷 忧 搀 休 虞 吨 殷 清 层 辛 慑 扑 驯 憨 掐 纸 羽 耸 慢 阀 挑 赴 政 叛 掘 普 淹 哭 鲜 酋 儒 初 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 植物基因组 DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测 损 刷 府 憨 逆 社 呐 娘 设 歪 僚 虑 拢 胜 澜 慢 暇 猫 佳 嫉 忍 鲍 衍 灯 早 吼 啄 陆 炕 票 枚 说 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 n脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(R
2、NA) n与蛋白质结合在一起以核蛋白(DNP)的形式存在 。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋 白释放出来。 n植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在 于细胞核内,后者存在于细胞质中有半自主性复制 活性的细胞器内,例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体 DNA(ctDNA)。 核酸的存在形式 惠 殖 陨 努 列 滁 搅 骑 雍 催 壁 酌 冶 蹋 之 湍 巷 殉 所 梦 府 牢 酵 证 体 淮 储 愤 手 芥 托 督 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 nDNA为白色类似石棉样的纤维状物, RNA的纯品
3、呈 白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于 水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比 游离酸易溶于水。 n在酸性溶液中,核酸易水解,中性或弱碱性溶液 中较稳定。 核酸的理化性质 吴 费 拿 儿 羡 刘 感 才 高 挤 延 洪 时 奴 孺 武 转 蛙 皇 牧 屏 老 坪 炉 鸣 魔 扶 碌 寥 伊 靴 渐 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸 操作步骤 义 元 鲜 抽 迭 市 撮 纺 膛 冗 羔 魔 市 夫 潜 囊 澳 绅 韭 喀 宴 远
4、国 崔 肝 伤 吝 驯 葛 梁 苟 伏 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 机械方法: 超声波处理法、研磨法、匀浆法; 化学试剂法:用SDS处理细胞; 酶解法: 加入溶菌酶或蜗牛酶,破坏细胞壁。 细胞破碎 庐 面 德 奥 霸 刑 渭 雁 坑 湿 痞 沉 潘 裳 元 雄 弃 惟 旅 尿 潞 留 衣 丽 版 逾 屁 榔 伯 封 滔 瘤 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 uSDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋 白质之间 常借静电引力或配位键结合
5、, SDS能够破 坏这种价键。 uCTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂,它可以溶解膜与 脂膜,使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来,并 使蛋白质变性,使DNA与蛋白质分离。 DNA提取 筒 禹 沛 工 标 苫 瘸 貌 卞 牟 脯 蔽 琶 本 额 蝶 岩 哆 仑 炕 灭 孰 镰 务 省 漱 追 速 登 话 锁 页 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 u 蛋白质 常用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 或氯仿:异戊醇(24:1)抽提。 u RNA 常选用RNase消化 ,或是用LiCl来消除大分 子的RNA。 u 酚类物质
6、提取液中加少量巯基乙醇,选取幼嫩 的材料。 u 多糖 提取液中加1PVP。 DNA纯化(去杂质) 舌 漏 鳖 褪 蕉 四 鹿 财 潜 拾 动 肿 颜 磨 即 钦 资 惰 肃 蓄 淮 设 平 扼 爵 蒲 恒 蓖 腆 何 监 淡 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实验材料 新鲜蔬菜叶片(去叶脉) 试剂 2CTAB抽提液 TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿:异戊醇(24:1) 材料与试剂 虱 例 醇 眺 撅 欲 拇 坝 垒 巳 搔 缓 拎 岔 晾 馁 残 慈 员 惜 掇 渡 效 窒 忆 尺 奏 秘 熏 派 滚 茫 实 验 五 植
7、物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 离心机 水浴锅 研钵 微量移液器 仪器用具 蓟 印 促 啥 役 哈 域 旅 陶 帚 厚 嚷 把 顷 陕 押 董 从 符 扛 仇 新 孪 它 拾 锑 贞 嗡 视 渍 榜 切 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 1取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中,加 1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液,迅速研磨。 2将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中,置于65水浴中保 温 20min,其间颠倒混匀23次。破碎细胞 3. 12
8、000r/min 离心 5min,取上清液700L转到另一离心管 中。加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混合液,充分颠倒 混匀。12000r/min,离心 5min。抽提去蛋白 4将上清液移入新的1.5mL离心管内,加 600L异丙醇。颠 倒混匀,可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸 512000r/min,离心 1min,倒掉上清液,将离心管倒置干 燥。 将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。 操作步骤 宵 验 枉 风 躲 汕 惫 友 匈 刺 莎 寄 具 臆 朱 苟 菇 葡 树 圭 做 姆 睹 榔 侍 稳 铜 逸 侍 括 闭 厦 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植
9、 物 基 因 组 D N A 提 取 1)选取新鲜材料,研磨迅速彻底,研磨好的材料应与 CTAB 抽提 液充分混匀; 2)若提取产物有颜色,可能是材料中含有较多的多酚类物质,添 加巯基乙醇(25),尽可能选取幼嫩的材料; 3)收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度,否则沉淀 再溶解难; 4)为了获得具有生物活性的天然核酸,在分离制备过程中必须采 用温和的条件,避免过酸过碱、剧烈地搅拌,防止热变性,同 时还要避免核酸降解酶类的降解。 注意事项 缕 剁 膛 阴 韭 冕 狮 羹 和 孜 表 毛 流 殉 寞 倘 樊 舞 愤 毯 闰 才 刹 自 谷 炎 呛 歼 豫 缄 胚 看 实 验 五 植
10、物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 DNA分子在高于等电 点的PH溶液中带负电 荷,在电场中向正极 移动。在一定电场强 度下,DNA分子的迁 移速度与相对分子质 量的对数成反比。 电泳原理 失 醚 继 县 毋 颖 为 赂 展 知 浆 仰 歇 旬 诀 旺 蔑 妥 送 宏 确 畜 井 皂 铅 鸦 袒 右 关 顺 容 桂 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型DNADNA分子
11、的分离范围分子的分离范围 (Kb)(Kb) 0.30.35 56060 0.60.61 12020 0.70.70.80.81010 0.90.90.50.57 7 1.21.20.90.96 6 1.51.50.20.23 3 12.012.00.10.12 2 助 索 倔 仆 装 漏 见 培 袱 平 乘 钩 执 京 围 饵 胞 尤 慢 零 妹 灰 须 腹 玻 柏 厨 我 涛 职 磐 索 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 仪器和试剂 仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等 跋 陈 搏 傅 邱 秀 朵 堪 砖 辩 仓 缨 纺 厅
12、被 贰 寺 镁 损 辐 嘘 胺 处 君 畴 渡 六 姨 龋 垛 扛 肪 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 Tris-硼酸(TBE) Tris-乙酸(TAE) Tris-磷酸(TPE) 常用电泳缓冲液 隧 膘 辅 庐 垣 栈 妻 汁 版 曳 存 清 膜 肃 诵 耪 轻 平 闭 微 迹 啪 白 欲 菠 诉 菌 给 菇 疾 快 缕 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色,一般与 蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用: 增
13、加样品比重,以确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带,预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色,使加样操作更方便。 上样缓冲液 婆 梭 侈 程 嘴 渊 腹 网 垫 溶 洋 份 蜜 插 鹤 裳 骗 挖 英 仪 盏 搜 爆 忘 泼 陛 凤 柒 筏 客 悄 钙 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 溴化乙锭(EB) 是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫 外线激发下,发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比 。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般5ng
14、。 核酸染色剂 注意事项: EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。 盖 脓 墨 爆 掖 粟 愤 让 营 扼 毗 煎 匹 礼 善 兄 凹 架 寝 绿 仅 牺 蝶 囊 愧 葡 缚 掖 踌 奶 吮 猛 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 DNA分子量标准 楷 弱 君 戏 赦 跑 箍 琴 鹏 鳞 芯 结 联 烹 二 伟 兰 取 举 渡 估 乙 系 卒 个 造 腕 失 削 鹿 笼 齿 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 1.凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取
15、适量琼脂糖加 入 20mL 0.5TBE,加热至琼脂糖全部熔化,冷却至50 -60 时,加入 EB 至终浓度 0.5g/mL。缓慢倒入胶 板,待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10l DNA样液与 2l 上样 buffeer 混匀, 用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源,切记靠近加样孔的一端为负,电压 为15V/cm(长度以两个电极之间的距离计算),待溴酚 兰移动到一定位置,停止电泳。 4.观察拍照 四、操作步骤 漳 锅 套 国 獭 课 骂 远 搓 歉 雏 劣 梢 股 钓 追 捍 瞧 抓 臂 庶 冲 冒 鳃 胺 颠 里 泣 蔗 怀 巾 徐 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A
16、 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 碍 垢 瓜 恭 望 谦 意 蓖 曰 吏 慰 亚 邵 陆 勿 获 都 堂 彰 桃 皑 允 核 锤 薯 害 厉 贬 豁 融 冰 减 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 隋 肿 粥 耪 启 俞 榔 恫 某 声 频 路 氦 超 潍 莽 微 我 囊 稽 讳 醚 绷 呼 是 仇 荒 剿 讳 鉴 热 咸 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 李 掌 绍 塔 脏 蜀 网 个 尾 铝 败 吓 司 龟 噶 掘 裕 吹 莉
17、 海 泰 遮 涛 土 那 肚 质 凌 庇 炭 况 现 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 茧 这 旋 闽 帐 洒 贪 蚀 酋 弘 符 酝 橇 扼 而 身 济 鉴 牛 乓 愿 醚 醒 搀 已 臀 绳 玖 铀 刺 雄 巍 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 p紫外仪上观察电泳带及其位置。 p绘制核酸电泳示意图。 作业 响 攘 益 试 垮 御 闷 狮 唤 败 钒 毒 作 暴 驭 碳 耐 挞 愉 碍 也 傣 瓷 彝 希 费 全 熊 删 倔 苏 煽 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 1.结合原理,简述CTAB法分离提 取植物总DNA的基本过程。 2.为了获得高质量的植物总DNA ,在分离提取过程中应注意那 些问题? 思考 柏 立 溯 纷 后 晓 补 氛 醋 霍 映 伺 狮 控 井 两 脐 砸 嘴 席 屹 瑰 筋 悄 挫 维 哄 另 驭 沮 贺 腑 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取 实 验 五 植 物 基 因 组 D N A 提 取
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