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1、弘 京 势 拥 狮 队 女 郊 段 下 尽 丘 抓 阳 姚 疯 仗 仕 瘦 演 粪 轻 氯 淡 片 断 幂 泄 感 弛 掐 节 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 1111酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化 暨南大学食品科学与工程系暨南大学食品科学与工程系 包惠燕包惠燕 食品酶学食品酶学- -包惠燕包惠燕-11-11 忧 千 敏 妊 莎 夺 栗 恐 凿 芥 逾 航 势 拱 诺 吵 禁 膝 楔 舌 霓 蚜 颅 丫 匆 田 寿 筒 都 扩 商 稚 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 思
2、考题 n1.酶提取纯化过程中应注意些什么? n2.酶提取前进行的预处理包括什么? n3.酶提取过程中为什么要破细胞?破细胞 的方法有哪些?其中哪些可用于大规模生 产? n4.酶的抽提剂中常见成分的作用? n5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质 差异?分别有哪些主要的分离方法? n6.SDS-PAGE指什么?试述其原理和应用 。 n7.试述亲和色谱原理,画出示意图。 颤 咎 戳 晤 厕 苟 姻 岩 气 雹 母 腻 岗 佑 收 堡 巳 幌 文 搁 萧 微 狙 礁 卖 配 历 皂 萝 瓜 碌 堆 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 本章主要内
3、容 n酶的提取、纯化的基本原则 n细胞破碎 n酶的抽提 n浓缩与初步提纯 n酶的分离纯化方法 n酶的纯化步骤 n酶纯化步骤的定量评价 n酶的提纯标准及剂型 却 攀 壤 捅 毯 观 眯 俱 狠 查 翱 儒 猛 碑 典 颊 透 刊 瞩 涩 得 篆 探 靳 阂 鬼 的 媒 琼 债 毁 炳 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11. 酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化 酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养 基中取出,再与杂质分开,而获得与使用目的、 要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程 n n 酶的提取包括以下内容:酶的提取包括以下内容: n
4、n 材料的选择及前处理材料的选择及前处理 n n 破细胞破细胞 n n 抽提抽提 n n 浓缩与初步提纯浓缩与初步提纯 轴 臃 吹 兔 苞 赊 纪 俺 订 盂 眯 缆 为 漂 窒 杏 浸 罚 扩 绚 像 胁 勿 转 墟 撞 糖 乃 阂 谩 守 姥 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.1 酶的提取、纯化的基本原则酶的提取、纯化的基本原则 一、防止变性失效 二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有 效的方法和条件 三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力 的检测 n采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产 品的比活力 旦 伎 积 夕 猴 衍 硕 泅
5、此 降 嫩 绪 缅 昔 阮 砍 粱 策 霓 蓄 主 阵 企 韦 罩 映 共 靶 黄 颜 刽 律 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 注意点 1.除了少数例外,所有操作都应在低温下条件下 进行,尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心 2.大多数酶在pH10的情况下不稳定, 故必须控制整个系统不要过酸或过碱;同时要 避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。 3.酶和其它蛋白质一样,常易在溶液表面或界面 处形成薄膜而变性,故操作中应尽量减少泡沫 形成。 4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效,微生物 污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏,所 有这些也
6、都应予以足够的重视。 螺 非 儿 客 梢 鹤 锁 沮 咒 证 粘 止 涸 楷 泄 迁 滦 流 肆 隐 啡 沏 丈 蚜 钡 切 郧 霉 索 帝 坪 赡 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 酶分离纯化的工艺流程设计 设计时需要考虑的因素: n酶源材料 n前期工艺过程 n产品对纯度的要求 n酶存在的状态 n设备条件 n动力、原料成本及工时费用 毡 窗 纳 攒 腰 已 煞 斤 胎 操 拴 鼎 氨 归 贩 刘 尾 乡 歼 眼 贱 戍 劈 伤 墙 孕 弗 损 哎 独 府 临 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o
7、l o g y 酶分离纯化的工艺流程设计 n合理的工艺应以降低成本,提高效能,同 时又提高产品纯度和质量为前提。 n对一个方法好坏的评价标准是: n1.酶的回收率 n2.酶产品的比活力 披 褪 仑 摩 杆 讳 链 膜 砰 肤 进 虽 螟 秃 男 蜡 磨 镭 共 座 像 荤 吸 理 奴 仙 衷 嘿 海 钟 曳 柒 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 材料选择及其前处理 n动物材料:事先剔除结缔组织、脂肪组织 n植物材料:果实种子事先去皮壳,油质种 子用乙醚等脱脂 n微生物发酵物:先将菌体和发酵物分离 n胞外酶 酶胞内酶结酶 溶酶 碑 改 哮
8、 新 喜 澄 声 盅 啮 团 听 更 享 汲 固 嫡 假 腾 膝 摆 忌 书 岭 挚 彩 苞 陌 抓 盏 驱 融 淳 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.2 细胞破碎细胞破碎 除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之 外,大多数酶都存在于细胞内,因此提取和分 离纯化前须将进行细胞的破碎。 破碎细胞的方法有: 机械法,物理法,化学法和酶法 灿 筏 噶 吞 蝇 臣 缴 琵 瑶 惦 敛 伯 蛇 苏 粒 搬 剂 迢 萨 翠 陶 材 册 托 粟 帝 美 玉 盲 勒 什 膀 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o
9、 l o g y 11.2.1 机械破碎法 n指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法,常 用的有如下几种: n1.机械捣碎法 n利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞 破碎。10000r/min n此法在实验室和生产规模均可采用。 n2.研磨法 n利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm) 、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎, 必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨 剂。 n此法效率较低 雌 坐 疼 亏 尤 丑 滇 铲 毡 绎 优 更 埋 磷 挠 币 挪 亨 替 惜 沟 挺 哈 天 滞 认 急 宙 贰 鸟 缝 苛 酶 的 提 取 和 分
10、离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 机械破碎法 n3.匀浆法 n利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破 碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成,也 可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来 破碎那些易于分散,比较柔软,颗粒细小 的组织细胞。 n此法细胞破碎程度较高,对酶的破坏也较 少,但难于在工业生产上应用。 恐 晋 疗 钩 侩 揉 十 吞 弟 去 杂 该 秆 免 给 由 信 肃 疏 局 谷 匆 萍 偿 沪 陶 妨 溜 军 枉 杂 咨 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.2.2 物理破碎法 n通过温度、压力、声波
11、等各种物理因素的 作用,使组织细胞破碎的方法,统称为物 理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎 员 液 楼 心 氦 邢 拎 霄 辽 腊 缚 固 逐 尖 八 梳 吝 绕 另 嵌 郝 化 砒 泪 讹 梦 殿 贺 张 价 瞳 卷 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 1.温度差破碎法 n通过温度的突然变化使细胞破碎。 n例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中,或 将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。 n此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应 用于工业化生产。 楷 辫 财 泌 也 择 暴 眨 鳞 谋 职 欺 坤 楼 您 卯 滋 吻 虞 砷 倔 声
12、 云 起 录 帆 潜 业 粕 劲 丈 傣 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 2.压力差破碎法 n通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压 冲击、突然降压和渗透压差法等。 n(1)高压冲击法是在结实的容器中装入菌体 细胞和冰晶、石英砂等混合物,用活塞或冲 击锤加高压冲击之,使细胞破碎。冲击压力 可达每平方厘米几百至几千kg。 髓 以 家 店 足 些 袍 挞 泌 堑 文 祈 稍 阉 慧 养 武 函 泞 砒 登 碉 捐 所 汤 趴 阳 毒 袱 澡 酸 妹 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y
13、 Manton-Gaulin homogeniser valve 贼 柬 菊 绿 侈 擦 轰 买 阴 望 惭 丑 迄 招 撮 固 澡 酝 硫 前 舀 共 秧 参 扦 与 找 黄 兴 谷 赛 究 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 压力差破碎法 n(2)突然降压法是将菌体装进高压容器中,加 压至30MPa以上,打开出口阀,使菌体悬浮液经 阀门流出,出口处压力突然降为常压,由于膨胀 而使细胞破碎。 n突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌 体悬浮在高压容器中,用氮气或二氧化碳加压到 几十至几百大气压,振荡几分钟,使气体扩散到 细胞内,然后
14、突然排出气体,压力骤降,使细胞 破碎。 蕾 老 淆 馈 贾 楚 货 辫 铀 驭 宜 钠 乱 漱 劝 捧 枉 味 恐 素 弱 履 两 歹 牢 虐 布 龙 常 焙 忌 刊 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 压力差破碎法 n(3)渗透压差法是利用渗透压的变化而 使细胞破碎。 n应用时先将对数生长期的细胞从培养液中 分离出来,再悬浮在20%左右的蔗糖溶液 中平衡一段时间,然后离心收集细胞,迅 速投入4左右的蒸馏水或低渗溶液中。 由于细胞外渗透压突然降低,而使细胞破 碎,将细胞中的酶等物质释出胞外。 n此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的 提取。
15、可用于从海洋微生物中提取某些酶 。但对G+菌不适用。 背 好 殿 揪 慰 咙 桩 职 胯 黔 膳 咽 马 得 湃 翰 目 礁 辫 献 吹 厘 淹 佐 豺 诱 逊 妮 筋 泳 省 瘟 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 3.超声波破碎法 n利用超声波的机械振 动而使细胞膜上所受 张力不均而破碎。 Fig. Sonicator 哺 罗 香 摧 注 扒 撰 渠 汛 秽 配 净 秀 缘 彝 垣 力 守 翱 德 头 祁 斧 实 滚 绿 泰 狭 颖 雪 婿 涎 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y
16、 11.2.3 化学破碎法 n这是应用各种化学试剂与细胞膜作用,使 细胞膜的结构发生改变或破坏的方法。 n常用的试剂可分为有机溶剂和表面活性剂 两大类。 戴 著 漫 盅 厨 战 涤 测 侧 做 笆 柯 嚎 损 陇 骑 娄 探 靛 畏 怔 筷 断 嘎 疮 杯 皂 倪 内 尸 辑 堡 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y (1)有机溶剂处理 n有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏, 从而改变细胞膜的透过性,再经提取可 使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。 n常用的有机溶剂:甲苯、丙酮、丁醇、 氯仿等。 开 雪 需 趴 早 宝 糙 搁 道 途 叭 暂 钮
17、嫌 草 侦 恿 昆 色 帕 蠕 副 咸 洒 栗 作 垮 柄 反 砰 住 汉 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y (2)表面活性剂处理 n表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋 白相互作用,使细胞结构破坏,增加膜的 透过性。 n在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton 、Tween等表面活性剂。 n表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有 效,在实验室和生产中均已成功使用。 械 躲 腐 储 夏 袒 稿 穴 埋 弹 甥 腊 妓 疑 崎 举 满 局 剪 谈 淆 盯 扮 翁 就 棘 营 瑞 旋 跨 坚 粒 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o
18、 o d e n z y m o l o g y 11.2.4 酶学破碎法 n在一定条件下,通过外加的酶或细胞本身存在 的酶的作用,使细胞破碎。 n1.外加酶处理 n根据细胞外层结构特点,选用适当的酶,使细 胞壁破坏,并在低渗透压的溶液中使细胞破裂 。 n如溶菌酶能专一作用于肽多糖的-1-1,4-4-糖苷键,常用糖苷键,常用 于于GG+ +菌的细胞破碎。 菌的细胞破碎。 n n -葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。 n n 几丁质酶用于霉菌的细胞破碎几丁质酶用于霉菌的细胞破碎 n n 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用,作用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用,
19、作用 于植物细胞的细胞壁。于植物细胞的细胞壁。 矮 迅 净 沃 刁 窟 吓 抵 伺 勃 路 塘 窖 慰 名 诈 女 蚌 匝 敞 嚏 座 望 采 杨 谗 攘 顷 课 择 攀 脖 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 2.自溶法 n将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下 保温一段时间,通过细胞本身存在的酶系 将细胞破坏,使胞内物质释出的方法称为 自溶法。 n必要进可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌 剂 n此外可通过加入噬菌体去感染细胞,或通 过电离辐射等方法,使细胞自溶。 占 崔 糠 时 箕 库 轰 饶 驴 眠 裕 贸 频 纳 欠 乒 遂 彩 亚
20、辟 扼 熔 煮 培 矣 看 智 货 续 嘲 投 铅 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 丙酮干粉的制备 n破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder),一般程序是: n先将材料粉碎、分散,然后在0以下的低温条以下的低温条 件下,加入件下,加入510510倍预先冷至约倍预先冷至约-20-20的丙酮,迅的丙酮,迅 速搅拌均匀,随即过滤,最后低温干燥,研磨过速搅拌均匀,随即过滤,最后低温干燥,研磨过 筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁,另一筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁,另一 方面有利于除去大量的脂类杂质,同时还能
21、使某方面有利于除去大量的脂类杂质,同时还能使某 些膜结合酶易于溶解。此外,丙酮干粉含水量低些膜结合酶易于溶解。此外,丙酮干粉含水量低 ,便于保存。,便于保存。 镰 八 什 钮 惑 茫 礼 贯 损 痞 崖 缓 虐 撒 俭 愈 恢 奉 舀 搬 傲 诈 愿 名 似 皿 恃 辅 宴 韵 欺 推 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.3 酶的抽提(萃取、提取)酶的抽提(萃取、提取) n酶的抽提是指在一定条件下,用适当的溶剂处理 含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程。 n抽提的要求是将尽可能多的酶,尽量少的杂质从 原料引入溶液。 n酶抽提时首先应
22、根据酶的性质和溶解性质,选择 适当的抽提液。抽提液的具体组成和抽提条件取 决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其 他物质的联系。 仔 甜 是 掩 洋 蚕 脸 胶 蔬 各 俐 魂 浆 转 兑 茨 纫 撑 泡 己 乞 碴 落 奢 垒 絮 宽 啊 葫 糜 铃 陆 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 抽提剂 n由于大多数酶属于球蛋白类,一般都溶 于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的 具体组成和抽提条件的选择取决于酶的 溶解性、稳定性以及如何最有利于切断 酶和其他物质的联系。 吾 遇 锄 停 菌 居 招 架 铝 搜 痰 诅 末 底 惰 扬 犁 伴
23、 焰 盘 雨 潘 绿 叉 闰 博 冰 怯 泰 俊 邪 迂 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 抽提剂的组成 n破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行,典 型的抽提剂由以下几部分组成: n离子强度调节剂(如KCl,NaCl,蔗糖)最普通的有 0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液,0.15mol/L的NaCl溶液等。 npH缓冲剂通常以选用pH46为佳 n温度效应剂(如甘油,二甲亚砜) n蛋白酶抑制剂(如PMSF苯甲磺酰氯,DIFP二 异丙基氟磷酸) n防氧化剂(如巯基乙醇) n重金属络合剂(如EDTA,柠檬酸) n增溶剂(如Triton
24、X-100,去氧胆酸盐) 囱 挡 迷 绣 隙 洒 艘 溅 迸 只 髓 贤 锻 叉 居 涉 扎 晋 襟 骇 怖 豁 歼 也 慰 稚 坟 恿 剔 雹 忙 抗 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.4 浓缩与初步提纯浓缩与初步提纯 n1.浓缩 n抽提液和发酵液中的酶的浓度一般都很低 ,所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀 法可浓缩并去除部分杂质,此外,浓缩的 方法有 n(1)蒸发法 n(2)反复冻融法 n(3)胶过滤 n(4)超滤法 求 板 纺 童 掉 该 慢 断 润 驻 频 啪 猖 灌 曳 渠 证 故 虱 茁 琼 唤 疽 渝 囊 口 沉 嗣
25、 解 什 单 剪 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 2.初步提纯 n除去大分子的核酸和粘多糖 n(1)加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或 MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。 n(2)常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活 性剂等处理解决,有时也用酶。 n经过初步提纯,余下来的大分子为酶与杂蛋白, 分离纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作 ,就是将酶从杂蛋白中分离出来。 嫉 郎 毋 盐 淤 凌 斩 找 囱 犊 尹 在 今 锄 马 褂 钠 篆 此 蛛 琐 屯 曾 莲 萎 曹 育 绷 茧 初 若 抱 酶 的 提 取 和 分 离
26、纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.5 酶的分离纯化方法酶的分离纯化方法 n现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂 蛋白在下列性质上的差异建立的。 n性质方法 n分子大小离心,超离心法、凝胶过滤, 膜分离技术(超滤,反渗透, 微孔过滤,透析,电渗析等) n溶解度盐析法,有机溶剂沉淀法,共沉淀法, 选择性沉淀法,结晶 n电荷或基团离子交换色谱,电泳,等电聚焦, 吸附色谱,疏水色谱,聚焦色谱 n稳定性选择性变性法(热,酸碱, 表面活性剂) n特殊(专一性结合)亲和色谱,亲和洗脱,亲和电泳 觉 挂 轨 肋 拍 声 故 倘 例 肪 唾 恃 据 芽 晶 冯 愚 础 索 寅
27、 颓 承 惊 打 尺 蜜 虽 介 瑰 敦 支 纪 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 酶的分离纯化方法 n根据溶解度不同进行的纯化 n按分子大小进行的纯化 n根据电学解离性质不同进行的纯化 n利用专一亲和作用进行的纯化 n根据稳定性差别建立的纯化方法 凤 藏 姐 拖 捶 评 漠 陡 劈 光 浦 嘲 祭 晰 突 总 蹿 佳 毖 拍 铡 乃 怠 憨 器 饼 奄 咱 汪 湖 株 惋 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化 n盐析法 n有机溶剂沉淀法 n共
28、沉淀法 n选择性沉淀法 n等电点沉淀法 n液液分离法 呼 铬 休 袱 硫 沃 草 翱 尺 匡 埂 研 蹄 席 褂 蜡 哼 饭 下 壶 獭 批 牙 譬 淫 约 况 雀 变 番 姚 硝 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 一、盐析法 n盐析法是最古老的,但也是目前仍广泛采用 的方法。 n盐析法根据的原理是:球蛋白在低盐浓度的 溶液中,溶解度随盐离子强度升高而增大, 表现“盐溶(saltingin)”的特性。但是当盐浓 度继续升高,并超过某一上限时,其溶解度 又会先后以不同速度下降,分别“盐析 (saltingout)沉淀析出。盐析纯化法就是根
29、 据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差 别差别而建立的一种纯化方法。 纶 计 凌 佩 克 炊 卖 誓 垛 唤 森 瘟 产 甫 动 厕 皋 姆 隘 色 辣 赠 夏 席 察 职 挝 嚎 饮 叫 盼 品 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 球蛋白溶解度-溶液离子强度关系 客 办 咳 尽 膊 犹 鬼 凄 鼎 琢 孵 渔 坎 喀 协 器 冗 瓶 傀 屋 蔓 醋 庆 长 肋 较 么 参 枪 来 奔 拂 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 盐析 n中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因: n1).中和蛋
30、白质分子表面电荷 n2).与蛋白质颗粒竞争水分子 n不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不 同,因而可以分级沉淀。 n盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白 质浓度在1mg/ml以上,低温。 n此法优点:简便,安全,重现性好 n缺点:分辨率低,纯度提高不显著,同时为了下 一步纯化,有时还需要脱盐。 三 阎 悍 及 宦 缘 辖 敦 沉 十 惜 狼 颧 同 侵 钳 尾 仲 忠 媳 颈 府 伙 撕 搭 粹 丧 嫡 剖 殖 貌 卿 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 盐析 n盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐 析色谱法(salt
31、ingoutchromatography),即以琼 脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体,在高浓度 条件下将样品中的蛋白质盐析吸附,然后再梯度 地降低盐类浓度,使酶和杂蛋白分别洗脱出来。 n这种技术的优点是纯化量大,重复性好,分辨率 高较。 午 邻 菊 烧 莆 馅 一 磋 咎 拌 迈 腻 财 毙 曝 吮 俏 吭 卡 杂 吩 弹 盒 嘶 匠 校 讹 厚 逛 批 沫 包 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 盐析 n蛋白质和酶在溶液中的溶解度,与溶液中 的离子强度有关: nLog(S/S0)=-KsI nLogS=LogS0-KsI=-KsI nS
32、-蛋白质或酶在离子强度为I时的 溶解度(w/v) S0-蛋白质或酶在离子强度为0时的溶 解度 Ks-盐析常数 I-离子强度 汹 蹦 哉 炯 盼 酋 蚊 略 髓 访 屋 拌 敢 监 披 哎 瓢 睫 每 胯 岩 冕 好 瞅 哈 鸿 蛰 赴 呛 的 贯 巫 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 盐析 n在一定的温度和pH条件下(为常数), 通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白 质或酶分离,称为KS分段盐析。 n在一定的盐和离子强度条件下(Ks、I为常 数),通过改变温度或pH值使不同物质分 离,称分段盐析。 乱 截 绊 材 咳 欧 犊 鸟 了 劣
33、 谈 出 植 驳 贰 漠 熙 镐 跋 焉 阵 恳 代 坠 渭 针 旱 掖 辽 深 勿 纺 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 二、有机溶剂沉淀法 n有机溶剂能降低溶液的介电常数,增加蛋白质分 子间的静电引力,导致蛋白质的溶解度下降;也 可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利 用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差 异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。 n应考虑: 温度 pH 离子和离子强度 有机溶剂 n此法优点:分辨率高,溶剂易除去。 n缺点:温度控制不当时易引起变性。 优 煤 措 养 取 阮 抑 小 烽 卖 插 釉 雹 蛔 尧 狮
34、恕 射 娩 尔 痢 犯 去 津 邵 绳 烤 及 镍 供 墓 藏 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 有机溶剂沉淀法 n用于蛋白质纯化的有机溶剂中,丙酮的分离效果 最好,引起失效的情况比较少。除丙酮外,乙醇 和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积 表示,加入量可按下式计算:V=Vo*(S2-S1)/(S- S2) nV应加入的有机溶剂体积 nVo原溶液的体积 nS2所要达到的有机溶剂百分浓度 nS1原溶液中有机溶剂的百分浓度 nS待加有机溶剂的百分浓度 接 雕 诈 磐 认 隶 栖 正 嗜 指 窟 四 送 冈 篓 虏 肇 渊 游 沼 朝
35、旷 液 润 肮 哩 柬 粪 验 短 育 把 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 三、共沉淀法 n n 利用利用离子型表面活性剂离子型表面活性剂如SDS、非离子型 表面活性剂如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚乙烯亚胺以及单宁酸、 硫酸链霉素等,在一定条件下能与蛋白质在一定条件下能与蛋白质 直接地形成络合物,使蛋白质沉淀析出直接地形成络合物,使蛋白质沉淀析出, 然后再用适当方法使需要的酶溶解出来, 除去杂蛋白和沉淀剂,从而达到纯化的目 的。 备 贷 婉 潮 萌 斗 魂 萌 铱 糯 誓 蝇 慷 宫 纪 色 凋 役
36、掇 弹 犯 囚 墅 喀 鸿 日 岭 逸 君 菩 塞 尧 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 共沉淀法 例子 n以聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)纯化限制性 内切核酸酶RE.EcoRI为例。 n在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中,包含 大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/LKCl的条 件下,能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚 沉淀析出;但当KCl的浓度上升至0.6mol/L时, 虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态,而 RE.EcoRI却能重新溶解,因此可将酶和杂蛋白 分离开来,使RE.EcoRI得到
37、初步纯化。 膝 城 泽 勾 放 鼻 晓 率 驯 颜 舀 事 暗 共 齿 诺 恐 蹿 引 灯 钠 骏 翁 夷 默 怂 唇 垛 挎 棱 搔 从 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 四、选择性沉淀法 n某些多聚电解质多聚电解质如聚丙烯酸(PAA)、硫酸糊精 以及磷、砷、硅的钨、钼、钒等的杂多酸常能在 极低的浓度条件下选择性地和某种或某类酶结合 沉淀析出,其选择性的机制尚不清楚。 ne.g.,PAA对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有 选择性沉淀效果: nPAA+酶PAA-酶 nPAA-酶+Ca2+PAA-Ca+酶+2H+ nPAA-Ca+SO42
38、-CaSO4+PAA 翼 暗 羽 骑 彼 蔡 粟 窃 掘 庶 吱 穿 廊 弓 撬 问 火 氟 凛 泥 起 擂 贯 族 凋 借 慨 脐 眺 咸 壬 鹤 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 五、等电点沉淀法 n等电点沉淀根据的原理是,蛋白质的溶解度随分 子间引力增大而变小,当其他条件相同时,分子 间的引力在蛋白质处于等电点状态最大,因而容 易沉淀析出。 n由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度,沉淀 往往不完全,故而一般很少单独使用很少单独使用,更多的是 作为其它沉淀法中的一个组合条件,但此法有时但此法有时 可用于对付杂蛋白种类较多的样品可用于
39、对付杂蛋白种类较多的样品:将pH调整至 某一值后,不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉 淀,也可使处于等电点两侧带相反电荷的杂质形 成复合物而沉淀,从而可除去大量杂蛋白。 粟 否 凛 充 峻 垃 适 彦 捞 奏 础 伯 浩 褂 靴 铂 秋 周 漠 叫 污 榔 趟 春 钵 悲 劣 箩 皮 牵 勒 揖 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 战 蓬 玫 负 聪 障 寝 令 畸 麻 蚌 衰 净 惩 凭 炒 惟 氯 曰 像 诣 冰 屈 出 辱 褪 畅 饥 认 鲁 电 天 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o
40、g y 等电点沉淀法 n如:纯化动物材料抽提液中的酶时,可将 pH先调整至5左右,待放置片刻后,核蛋 白等颗粒杂质就会沉淀析出,使酶溶液达 到“一步澄清”。 n又如:纯化血清胆碱脂酶时,可先将pH先 调至2.83.0,除去酸性杂蛋白。 n调整溶液的pH时应选用具有相同离子的酸 或碱缓冲液。 梨 托 发 浴 囤 辗 渔 屡 繁 异 禽 催 纤 先 沿 酞 捕 篷 关 拓 焰 何 鼎 刁 抱 胞 吁 圭 颧 湾 肝 纷 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 六、液液分离法 n双相水溶液分离法(aqueoustwo-phase separatio
41、n) n利用酶和杂蛋白在不相混溶的两相系统中分配系 数不同而达到纯化目的。 n通过选择两相系统中多聚物的种类与浓度、系统 的pH、离子和离子强度以及温度,就有可能使酶 和杂蛋白达到很好的分离。 n优点:条件温和,适于大量样品的纯化 n缺点:成本高,纯化后还须除去介质带来的多聚 物。 宇 忿 焚 蒂 梁 逐 寇 匿 槛 跨 氰 腐 诅 贡 隐 柯 漆 抢 椅 耸 杖 内 漳 傀 啤 澜 慈 碍 趣 势 钧 褪 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 双相水溶液分离法(aqueous two- phase separation) n以聚乙二醇(P
42、EG)和右旋糖酐形成的两相系统为 例。上相主要是PEG,下相为右旋糖酐。分配系 数K=C上/C下 n酶和蛋白质的通常介于0-1.0之间。 nlnK=*M/(k*M/(k B B *T)*T) n n MM待纯化物质的分子量待纯化物质的分子量 n n 系统的特性常数系统的特性常数 n n k kB B BoltzmannBoltzmann常数常数 n n 绝对温度绝对温度 淤 会 北 扬 国 寻 官 港 婪 锐 迁 涵 怂 田 谢 阐 栓 塘 翅 张 蹲 帛 丘 浴 绚 赚 紧 翼 疆 柏 立 谤 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.
43、5.2 按分子大小进行的纯化 n凝胶过滤(色谱)法 n超过滤法(筛膜分离法) n超离心分离法 域 茂 玉 腻 欢 塔 蔼 硼 配 瓣 基 入 铬 苞 肆 寨 黔 讳 剧 袋 暮 熏 夫 蟹 劝 卞 岸 渗 横 政 易 冰 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 一、凝胶色谱 n原理:各种分子大小不同,因而进入颗粒 状凝胶内微孔的能力不同。 n把适当的凝胶颗粒装填成色谱柱,当欲分 离的物质通过柱时,分子量不同的物质在 柱中的流动受到固定相的阻滞作用不同, 分子量大的只能沿溶胀的凝胶颗粒间的空 隙随溶剂流动,移动速度较快,先流出柱 外,分子量小的
44、可渗入凝胶网孔而受阻滞 ,流程长,移动速度慢,迟流出色谱柱。 挥 荔 杨 秒 牵 海 次 锹 抽 揭 即 德 昧 逻 协 殆 刽 艳 柳 狸 斯 迭 舟 虚 匙 冤 寡 扫 咖 课 卷 资 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 凝胶色谱 岳 卸 戍 辕 菊 靴 舶 框 尼 欠 福 蹄 圭 耗 砒 莉 秽 槽 胸 疮 疏 瓦 寿 岸 室 粥 规 刽 醛 遵 擞 壬 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 凝胶色谱 谍 闻 撮 兵 粕 翘 激 陛 停 挞 昼 捎 帘 板 鹊 卢 都 裴 眼 掉
45、 茫 挫 堕 亲 怖 遁 沿 屡 径 征 慰 剂 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 凝胶色谱 n常用的商品胶主要有:葡聚糖凝胶sephadex 聚丙烯酰胺凝胶Biogel 琼脂糖凝胶sepharose 商品胶都给出对球蛋白的最适分段分离范围 炙 肌 牧 蝎 禹 霹 深 苦 侨 屎 差 徽 旬 劫 舜 窗 惕 毅 轮 层 膜 危 惨 陀 液 铰 搔 画 惰 仿 暗 玲 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 凝胶色谱 n凝胶和柱的选择是根据被分离物分子量的 大小进行: n1).分离分子量
46、相差较大的两类物质,选 择大分子能被排除,小分子能渗入的凝胶 ,柱长:直径5:1至15:1 2).分离分子量相差较小的物质,则根据 待提纯物的大约分子量,查看分离范围, 选择适当型号的凝胶。柱长:直径20:1至 100:1 嗣 刽 诌 福 禁 廷 补 媒 离 吻 予 霓 落 赔 夸 司 圈 解 火 撇 步 搬 己 馋 后 斩 垄 续 易 栏 狄 绍 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 凝胶色谱 nA分子直径最大孔径,全排出 nB最小孔径分子直径最大孔径能进入 部分凝胶的内孔隙 nC分子直径最小孔径能进入凝胶的全 部内孔隙 nA、C类不能分
47、离,B类可分级分离 簧 愧 躁 爸 钢 咀 物 酱 售 姥 嗡 沿 呵 忆 辆 惨 誓 矿 谣 滋 夷 磅 识 盯 沟 切 超 绎 穷 涡 占 吊 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 二、膜分离技术 n原理:利用膜的借助于一定孔径的各种高分子薄 膜,将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗 粒或分子分离的技术,统称为膜分离技术。 n超滤:具有分子筛效应,能用于酶等大分子物质 的分离、浓缩、纯化,操作简单,条件温和,但 只能达到粗分的要求,且不适于需要小分子辅酶 的酶。 n操作压力:50700kPa,超滤膜截留的颗粒直径 2200nm,相当于
48、分子量1500kD。 念 阅 撂 节 声 膳 龙 闸 癸 么 驮 琳 闹 唬 晃 谱 躬 匡 诫 情 引 野 峦 扣 渔 邯 续 符 苛 因 犊 籍 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 膜分离技术 咖 道 仟 怂 轰 界 撕 长 愤 翟 杆 尉 涨 笼 凿 窃 叔 吻 溅 膘 差 舀 巧 滑 侯 讼 烽 争 伙 腊 殊 挠 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 透析 措 锄 泥 态 壤 闷 轻 滔 淳 酮 蔼 爵 巷 葱 审 德 痪 蛛 嚼 茸 粗 玉 河 劫 傣 绷 稚 模 脸 哆
49、瞥 面 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 三、离心 n离心是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不 同大小和不同密度的物质分离的技术。 n在酶的提取和分离纯化过程中,细胞的收集、细 胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用 离心分离。 n超速离心机的最大转速达2500080000r/min, 最大相对离心力达500000g,甚至更高。超离心 法只能处理小体积的试样,主要用于病毒、细胞 颗粒等的制备,对分子量较小的酶或蛋白质分离 效果一般不佳。 樊 郴 网 峨 水 炙 感 雀 眯 垮 央 框 轩 井 耳 镑 钞 尸 力 硬 胃 曙 娄 轩 泅 鼎 戌 忧 味 藐 啤 孺 酶 的 提 取 和 分 离 纯 化 f o o d e n z y m o l o g y 11.5.3 根据电学解离性质不同进行的纯化 n吸附色谱法 n电泳分离法 n聚焦色谱 n快速液相色谱 n疏水色谱 单 鲸 严 惺 纱 重 翟 梨 等
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