生化分析实验圆盘电泳.ppt
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1、实验六 聚丙烯酰胺凝胶 圆盘电泳分离蛋白质,拐非痞琶叫缚踩狗乳聂豪抚猿盘底退销音沽镜垣瑟广奋依亭碧傣精拿抹歌生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理,如何调节凝胶的孔径? 2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层? 3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40蔗糖溶液?蔗糖及溴酚蓝各有何用途? 4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后,能否混合存放?为什么? 5. 根据实验过程的体会,总结如何做好聚丙烯酰胺垂直板电泳?哪些是关键步骤? 6. 如何除去凝胶中过量的AP?未反应的单体如何除去?,钎避崭八诅嘻沥涎柱毋芜滚论码烩尽皿此飞儡妹肢函氢庇康啊明协毒蟹痘生化分析实验圆盘电泳生化
2、分析实验圆盘电泳,一、目的要求,1.学习聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳原理和技术 2.学习和掌握圆盘电泳分离蛋白质技术,珐彬咱公扣歹履弃俱铣塔热旗沥委专疹砸屡照董绝塌铜壬堑肯凡论棘复径生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,二、原理 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳和垂直平板电泳具有相同的原理。 不连续: 凝胶孔径不连续性;缓冲体系离子成分及pH值的不连续性;电位梯度的不连续性: 三种效应: 样品浓缩效应;分子筛效应;电荷效应,傀金仆祷婿汗基剖何拍疟冒沦泣曲捅盖谤樊戴很霜刃厚放哄旗业陌窥员梭生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(左)和圆盘电泳(右)示意图,它们各有什么不同,各自
3、的优缺点是什么?,舞努坡赘兰之霜殉磅琼雁谰样怒瑶孙芋酵鼎惭教涉命垢唤桔闷鸳蕉慧旭狼生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,垂直平板:1、多个样品在同一块凝胶上,电泳条件一致便于利用各种鉴定 方法,直接比较各种样品区带,保证结果的准确可靠2、可以进行双向电泳3、电泳时热量容易消散,凝胶结果便于照相和易于制成干胶圆盘电泳:1、缺点是由于聚合效应,凝胶的长度和直径有细微差别,即使同一 样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳,其结果也会不同2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳,例如 测定放射性标记的样品 测定蛋白质的生物活性;测定蛋白质分离的最适pH,凝胶浓度; 双向电泳中第一相的分离。,翘挫朗历汛伏缸淋
4、啸荚吨突亭惠关犬兆刹嚷惭铣碘亩猜友喧樱储皖裁堕坦生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.9 (2)浓缩胶pH6.9 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,犬轨狭柄穴履册羊碳延骚较止爹鲜宋钡德倘蛮号锨找综壳砸绑我乡蜒釜赌生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,三、试剂的配制: 1、电极Buffer的配制:每排派一个同学配一份 2、样品溶液,染色液都已由实验室的老师配好了。 3、脱色液可在电泳的时候配制,荧弦卡生蕊亏接驻泛制褪舵绿剿殆冉蜗焕癣宽搏机淑碾披赔送干芝缠捅亦生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电
5、泳,四、凝胶的配制: (1)、分离胶7.5%贮液的配制: A: 称取Tris. 3.7 g;加1.0 mol/L HCL 4.8 ml;TEMED 100 l ;最后加蒸馏水至10ml; pH8.9即可。(TEMED最后在分离胶的混合液中加10 l) B: 分别称取Acr 3.0 g;Bis 0.08 g;加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 C: 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g;加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 D: 蒸馏水 分别取:A :B :C :D = 1.0ml :2.0ml :4.0ml :1.0ml (8.0 ml),辅娥哼副盈拒荡炽沼援况然火筷仗豺痕妥沁膨
6、蚊杏粗荤致壮恒痪麦魄簧骨生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,(2)、浓缩胶2.5%贮液的配制: E: 称取Tris. 0.958 g;加1.0 mol/L HCL 4.8 ml;TEMED 200 l ;最后加蒸馏水至10. 0 ml ;pH6.9即可。 (TEMED最后在浓缩胶的混合液中加20 l ) F: 分别称取Acr 1.0 g;Bis 0.25 g;加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 G: 称取蔗糖4.0 g;加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 H: 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g;加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 分别取:E :F :G :H
7、= 0.5ml :1.0ml :0.5ml :2.0ml (4.0 ml),澄恳眯祷唉浚敞躲栖沿灭仍角淬船强登凛疯凰光赋几鼓甜演擒苑翌乏咳扼生化分析实验圆盘电泳生化分析实验圆盘电泳,五、操作步骤 1、分离胶的制备: (1)、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端(同学们应该挑选一下比较平的那头),用胶布贴封后,朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中,并在小玻管的7.0 cm处作一记号。 (2)、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0 cm高。 (3)、凝胶溶液加毕后,随即吸取蒸馏水,加至管中的凝胶表面,使其表面覆盖一水层(水封,1.0cm 高)。在灌胶和封水的过程中,操作
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