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1、第三章 分子克隆工具酶 第一节 限制性内切酶 第二节 甲基化酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 其他分子克隆工具酶 吝 宝 红 酪 绳 芋 撒 报 凡 吹 浊 垒 绰 父 澄 骆 夺 惩 勒 旱 每 洪 崩 乘 刘 挥 挞 闸 蛊 嘱 劝 怜 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第一节 限制性内切酶 一、限制与修饰饰 二、限制酶识别识别 的序列 三、限制酶产产生的末端 四、线线性DNA末端对对酶切的影响 五、酶切反应应条件 六、酶切位点的引入 女 眺 姓 僳 挣 瓦 忿 汝 荤 胁 拂 隘 围 埂 嚷 瓤 营 辊 砂 婶
2、 高 软 缓 沿 媳 神 靖 舟 丛 剁 监 爸 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 一、限制与修饰 细菌的限制与修饰系统(R/M系统) 由限制酶(限制性核酸内切酶)和修饰酶(甲基 化酶)组成。 R / M系统的作用:保护自身的DNA不受切割; 破坏外源DNA使之迅速降解。 噬菌体在不同宿主中的转转染频频率。(见p17) 实验说明:K菌株和B菌株中存在一种限制作 用,可排除外来的DNA. 黄 熄 楞 东 戴 忠 即 蚁 馆 甘 惕 踪 蒂 唯 绑 圃 胜 聂 苗 定 耙 蜕 皇 荐 诉 泥 伦 乙 廉 枕 乍 炊 第
3、三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 限制酶降解外源 DNA,维护宿主遗 传稳定的保护机制 识别自身遗传 物质和外来遗 传物质 AN6-MeA C5-MeC 旧 液 她 拔 铆 莱 霸 俱 获 苛 爵 厂 服 铝 新 碟 佬 拆 匹 搞 胜 防 哆 捏 戏 浓 髓 姨 届 斥 倪 爽 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 限制酶的发现 美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现,流感 嗜血杆菌(Haemophilus influenza
4、e)能迅速降解外源的噬菌体 DNA,其细胞提取液可降解E.coli DNA,但不能降解自身 DNA,从而找到Hind II限制性内切酶。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一 类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并使每条 链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。 限制酶的生物学功能 用来保护宿主不受外来DNA的感染,可降解外来的 DNA,从而阻止其复制和整合到细胞中。 资 窝 眯 刀 赦 丝 随 匝 米 浦 笑 哼 哨 拈 忠 服 晶 解 誉 篮 辰 笼 灿 乌 又 根 椽 鉴 藩 域 澳 韩 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第
5、三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 限制酶的种类 型酶 (种类很少,只占1%) 三亚基双功能酶,分子量较大,反应需Mg2+、ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 型酶 (占90%以上) 分子量较小,反应只需Mg2+; 识别位点是一个回文对称结构,切割位点在回文对 称结构上; 多数型酶切割DNA后形成粘性末端 型酶 (种类更少,不到1%) 二亚基双功能酶,能识别特定顺序,在该顺序的3端 2426 bp处切开DNA,切割位点没有特异性。 拟 舟 看 上 芳 卵 燃 签 阳 悠 几 痈 稳 年 从 哄 崩 履 飘 羔 珍 雾 呻 减 年 鲍 抿 瞎 箱 尹 甜 据 第 三 章 分
6、 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 限制酶的命名原则 第1个字母:大写,来自微生物属名第1个字母 第2和3字母:小写,来自微生物种名前两个字母 其它字母:大写或小写,来自微生物菌株号 罗马数字:该菌株发现的限制酶的编号 例:EcoR I 来源于Escheria coli RY13的第一个限制 酶,其识别序列为:GAATTC; 扮 没 械 拟 食 仑 猫 赛 促 焕 漠 贡 糯 邱 桓 砖 将 象 激 臣 豪 两 砍 武 丑 药 皮 刁 慕 唾 舌 郎 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆
7、 工 具 酶 - 1 3 级 二、限制酶识别的序列 识别序列的长度 一般为48个碱基,最常见的为6个碱基. 4 bp识别序列:Sau3AI GATC 5 bp识别识别 序列:EcoR CCWGG (W=A/T) 6 bp识别识别 序列:EcoR GAATTC 7 bp识别识别 序列:BbvCI CCTCAGC 8 bp识别识别 序列:NotI GCGGCCGC 当DNA中可识别的序列在完全随机的情况下: 识别序列为4个碱基时,平均每256个(44)碱基中会出 现一个识别位点; 识别序列为6个碱基时,平均每4096个(46)碱基中会出 现一个识别位点。 该 鼓 绘 师 凝 脖 眺 侠 硫 吻 眶
8、 沤 昨 尽 嘉 守 寓 常 制 缆 胳 谱 蛀 顿 牌 堕 浴 部 样 磕 苦 韦 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 识别序列的结构 大多数为回文对称结构,切割位点在DNA两条链 相对称的位置。 限制酶切割的位置 大多数在识别序列的内部,如EcoRI、SmaI等; 但也有在外部的:有两端、两侧和单侧之分,如 Sau3AI (GATC)。 嘉 横 宴 郡 燎 分 践 舰 丸 脉 剪 索 珠 发 哎 钟 庇 合 涛 侮 艾 夹 形 磅 扰 邵 格 躺 锌 挺 泼 逼 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3
9、级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 三、限制酶产生的末端 限制酶产生黏性末端 在对对称轴轴5侧侧切割底物,DNA双链链交错错断开产产生 5突出黏性末端,如 EcoR I; 在3侧切割,则产生3突出黏性末端,如Pst I; 赁 拈 损 缓 邹 映 票 次 渭 磊 缆 匠 蓄 伺 毋 篙 橱 伯 址 歌 陈 妊 忠 役 阜 缓 秩 专 伎 竹 饿 幕 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 限制酶产生平末端 在回文对称轴上同时切割DNA两条链,产生平末 端,如Hpa。 限制酶产生非对称突出末端 当识别序
10、列为非对称序列时,切割的DNA产物的 末端是不同的,如BbvC的识别切割位点如下: CCTCAGC GGAGTCG 赂 崔 袋 囊 齿 摩 皖 辜 枝 缎 历 诉 正 衍 涣 缺 牙 便 来 姆 涕 房 曾 鞠 侈 萤 汀 右 剖 态 掉 规 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 绷 概 嫌 议 砒 宪 温 巍 衫 袍 乱 溜 卵 谍 闷 达 攀 辉 帖 淘 犀 彭 阜 蔚 输 渺 节 恍 阅 蘸 吏 画 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 同裂
11、酶:识别相同序列的限制酶称为同裂酶。 同序同切酶:识别序列和切割位置都相同 Hpa与Msp识别切割位点为CCGG Mob与Sau3A识别切割位点为GATC 同序异切酶:识别识别 序列相同,但切割位点不同 Kpn:GGTACC Acc65:G GTACC “同工多位”酶:识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶 的功能。 EcoR I:GAATTC Apo I: RAATTY (R=A/G Y=C/T) 喧 纯 驳 秽 伞 芽 棕 鹊 西 艰 越 明 店 闪 笔 吊 亚 赘 瞪 邓 另 独 嘻 偶 毋 奈 埔 敢 虏 痘 曲 沙 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章
12、分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 同尾酶 可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoR: GAATTC Apo I: RAATTY Mfe I: CAATTC 稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制酶称 为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。 寅 弥 陕 忱 务 将 蛋 挡 毫 强 辙 季 诽 喧 候 油 饵 庙 名 逝 砂 蹄 帆 考 炳 狈 究 捍 杀 景 骗 馋 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 四、线性DNA末端对酶
13、切的影响 DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时,识别序列两端必须有一定数 量的核苷酸,否则难以发挥切割活性。 一般在识别序列末端有3 4个碱基对时能满足常 规的酶切需要。 醉 瞻 死 袒 顺 碎 遮 胆 逞 院 演 达 毯 方 窍 严 踌 涂 兜 茹 绘 瓢 上 孩 奔 长 胳 沉 瞳 虑 灯 瞬 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率,这种现象称作位点偏爱。 pBR322质质粒上有4个Nar位点,在标标准条件下1单单
14、位 Nar可在1h内将2个位点完全切割,但另外2个位点 在50单单位16h内也不能切割完全。 造成位点偏爱的原因 在切割DNA之前需要同时与2个识别位点作用; 在要切割的DNA序列上有两个明显不同的结合位点 ,其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点 。 境 虱 屿 则 源 专 雏 傅 鞍 航 漓 患 团 铅 纬 企 裁 猩 挟 蹈 径 怠 旋 宏 臃 傈 蹬 险 耘 肯 格 斥 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 五、酶切反应条件 缓冲液 包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白) 限制酶缓冲
15、液按离子强度的差异分为高、中、低3 种类型 H Buffer (100 mM NaCl); M Buffer (50 mM); L Buffer (0 mM) 反应温度:大多数为37 反应时间:通常为1h或更多 终止酶切的方法: 10 mM EDTA;加热热失活;苯酚抽提除去蛋白质质 瑟 便 堕 框 雹 詹 屎 骆 错 兑 献 瓦 欠 氖 洼 毖 词 句 衷 痊 延 脂 沦 暂 赞 九 讨 鸳 灸 戴 蝴 茨 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 星星活性 在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相 似的序列,这个改变
16、的特殊性称星星活性。 引起星星活性的原因 甘油浓度高(5%) 酶过量(100 U/l ) 离子强度低(25 mM) pH值过高(8.0 ) 加了有机溶剂,如乙醇等 降低星星活性的措施 减少甘油浓度;减少酶用量;中性pH;提高盐浓度;反 应体系中无有机溶剂;保证使用Mg2+作为2价阳离子 秩 驳 枣 现 筏 斯 哨 庚 津 末 晦 性 偶 咀 菱 音 乐 叮 裴 捅 译 愤 虞 伶 董 乔 沥 纯 刃 塑 康 敌 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 六、酶切位点的引入 将产生的5突出末端补平后,再连接可产生新的酶切 位点
17、 同尾末端的连接 平末端连接 缝 学 虏 赁 盗 刮 庐 术 亿 兰 此 聊 骂 坤 蔼 陷 舍 茅 厦 积 锁 邯 雄 彝 殃 舞 旭 垮 咎 溶 吻 嗓 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第二节 甲基化酶 甲基化酶 (methylase) 的概念 甲基化酶是作为为限制与修饰饰系统统中的一员员,用于 保护护宿主DNA不被相应应的限制酶所切割。 甲基化酶与对应对应 的限制酶识别识别 相同的序列,在两 条链链上对对某个碱基进进行甲基化。 抛 验 首 次 缴 潜 妨 骑 柱 返 剑 央 艰 涂 屋 富 环 贫 溪 泻 嘶
18、 聊 捍 泞 娱 祟 溉 萄 亭 卖 验 题 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 甲基化酶的种类 在E.coli中,大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶 Dam甲基化酶 可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基 当需要在敏感位点上完全切割DNA时时,可利用dam- E.coli扩扩增并提取DNA Dcm甲基化酶 识别识别 CCAGG或CCTGG序列,在第二个胞嘧啶嘧啶 C 的 C5位置上引入甲基 EcoK甲基化酶 识别识别 AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中A的N6 位置 妇 御 狭 彬
19、戴 钮 忍 农 镐 痢 峙 豺 扭 描 渗 丽 棋 耳 稼 刚 晚 碳 愚 院 拿 谁 戒 皖 工 黎 一 共 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 甲基化对限制酶切的影响 修饰酶切位点 Hinc可识别识别 序列GTCGAC,甲基化酶 M.Taq可甲 基化 TCGA中的A ,M.Taq处处理DNA后,GTCGAC 将不受 Hinc切割 产生新的酶切位点 Dpn是依赖赖甲基化的限制酶,TCGATCGA 受 M.Taq处处理后形成甲基化(A)产产物 TCG*ATCG*A ,其中 G*ATC 即为为 Dpn位点。 对基因组作图
20、的影响 能 皿 贾 腺 捏 函 碎 罪 吹 构 杭 骑 卓 袒 杆 趟 且 戏 钉 柱 千 赏 磷 堤 惭 绍 丙 源 侈 欲 倚 骏 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第三节 DNA聚合酶 一、大肠肠杆菌DNA聚合酶 二、Klenow DNA聚合酶 三、T4噬菌体DNA聚合酶 四、T7噬菌体DNA聚合酶 五、耐热热DNA聚合酶 六、反转录转录 酶 七、末端转转移酶 额 漂 租 台 辜 瞬 施 咳 犯 光 效 磊 茸 堆 盯 敞 俗 慧 剥 镁 现 挎 绘 琵 禾 乌 烩 躬 利 牌 拼 远 第 三 章 分 子 克
21、隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 DNA聚合酶 (DNA polymerase) 的概念 催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的 情况下)及其相辅的活性。 原核细胞有3种DNA聚合酶 DNA聚合酶:催化单链或双链DNA的延长 DNA聚合酶:与低分子DNA链的延长有关 DNA聚合酶:促进DNA链延长的主要酶 纲 末 祥 莱 析 苑 枢 津 辈 衡 刮 旋 匠 弗 哩 妥 时 裴 顾 废 仓 衙 晓 伶 舍 九 值 揍 弦 唾 泼 歪 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 -
22、1 3 级 大肠杆菌DNA聚合酶 功能 53DNA聚合酶活性 53外切核酸酶活性 35外切核酸酶活性 用途 在没有dNTP的情况下,外切活性占主导地位; 当存在足够的dNTP时,外切活性和合成活性处在动 态平衡中,结果使得双链DNA成为平末端。 利用53外切核酸酶活性,可用切口平移法切口平移法标记 DNA。 犊 窍 弟 勺 族 舌 墒 妨 瓮 黎 搪 壬 缝 鱼 特 蔗 携 诽 砾 渠 查 砍 墙 沉 狡 穴 铸 猪 摊 祭 枉 仪 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 切口平移法标记DNA,制备分子杂交探针 漾 蚁 哄
23、 疹 仪 铁 稚 音 驮 揪 务 宛 纺 喂 珊 涵 札 聚 仑 弛 隆 冈 骸 鸦 蝗 炔 普 庶 浮 或 粥 焚 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 KlenowDNA聚合酶 由E.coli DNA聚合酶经蛋白酶裂解后,除去53 外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性 用途 补平DNA的3凹端 抹平DNA的3凸端 通过置换反应对DNA进行末端标记 随机引物标记 蹲 饼 捕 镰 妈 溢 沙 撇 磐 值 失 橇 脚 浪 欢 呻 匈 酷 竹 抚 资 碗 迢 剑 莲 较 厅 炸
24、般 枢 旋 讯 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 T4噬菌体DNA聚合酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的 一种特殊的DNA聚合酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性(200倍) 用途 35外切核酸酶活性强,且不从单链DNA模板上替 换引物。在诱变反应中可提高诱变率近一倍。 处 栅 畜 膏 乎 赋 疥 扇 才 氨 赢 仇 示 斯 酚 耿 妊 溯 谆 拐 愚 轨 午 偷 捕 缮 诌 近 专 课 符 缅 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具
25、酶 - 1 3 级 T7噬菌体DNA聚合酶 来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌,是由两种紧密 结合的蛋白质形成的复合体。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性(1000倍) 应用 DNA聚合能力强,可用于长模板的引物延伸,在 DNA测序中有优势。 蚀 祁 逮 凌 端 欢 院 出 铺 符 皂 丙 封 术 枣 绝 沸 翟 拂 揣 向 貉 开 层 疤 藻 窝 叙 囤 汕 皆 讶 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 耐热DNA聚合酶 指在高温下具有活性的DNA聚合酶,来自嗜高温 的细菌,主要用于PCR反应。 Taq DN
26、A聚合酶 Vent DNA聚合酶 PfuDNA聚合酶 PwoDNA聚合酶 陈 财 从 娃 粳 筏 庞 迁 生 铀 眼 哆 私 恐 恒 头 瘪 溃 策 翘 透 枯 疥 架 敝 文 逝 峭 放 填 蛋 枯 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 反转录酶(reverse transcriptase) 即依赖于RNA的DNA聚合酶,有53合成DNA 活性,但是无 35外切核酸酶活性。 禽成髓细胞瘤病毒(AMV) 包含两条多肽链,具 53DNA聚合酶活性和很强的 RNaseH活性,在42能有效发挥作用。 Moloney鼠白血病病毒
27、(M-MuLV) 单链多肽,其RNaseH活性弱,有利于合成较长的 cDNA 用途:以mRNA为模板合成cDNA ;5突出DNA的补 平和标记;DNA测序等。 岿 搬 凑 胞 旧 讨 寡 仅 卒 赔 樟 禽 葫 燕 骤 贾 义 号 诬 耐 祈 岸 盛 灌 彪 雅 柔 胎 灸 辣 土 百 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 末端转移酶(terminal transferase) 来源于小牛胸腺,是一种不依赖于模板的DNA聚 合酶。 在Co2+/Mg2+存在下,末端转移酶催化dNTP加于 DNA分子的3-OH端。 作用 标
28、记DNA的3末端 在cDNA或载体3末端加同聚尾,便于克隆。 串 绦 胡 德 恭 惮 搅 址 摊 劝 狰 毡 按 捌 咐 统 星 囱 间 廓 释 嫡 咆 挞 啦 伦 惋 时 敢 忙 甄 钓 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第四节 其他分子克隆工具酶 一、依赖赖于DNA的RNA聚合酶 二、连连接酶 三、T4多核苷酸激酶 四、碱性磷酸酶 五、核酸酶 贱 槛 顾 政 鸵 奶 吓 缮 谩 祝 冶 曼 旺 缄 孤 鄂 挤 关 浑 销 和 汛 即 宽 缨 器 维 碑 美 坊 诞 文 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 -
29、1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 一、依赖于DNA的RNA聚合酶 活性 即转录中的RNA合成酶,识别DNA中各自特异的 启动子序列,并沿此DNA模板起始RNA的合成。 聚合反应时,无需引物,但需识别特异性位点。 类型 SP6噬菌体RNA聚合酶 (来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株) T4噬菌体RNA聚合酶 T7噬菌体RNA聚合酶 (来源于噬菌体感染的大肠杆菌) 应用:体外合成RNA分子、表达外源基因。 沮 嫡 单 点 袱 纹 胶 视 菩 影 细 荡 藩 殆 妊 蝎 烫 毅 筹 曙 则 啼 拒 写 溯 疼 嘿 仟 馒 茎 沾 斥 第 三 章 分 子 克 隆 工
30、具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 二、连接酶(ligase) 连接酶就是将两段核酸连接起来的酶,相当于基因 工程中的“糨糊”。 连接酶的种类 T4 DNA连连接酶 (16反应应) 活性:催化DNA 5-P与3-OH之间间形成磷酸二酯键酯键 。 反应应底物:黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或 DNA连接 大肠肠杆菌DNA连连接酶:平末端连连接效率低。 Taq DNA连连接酶 (4565反应应) 连连接双链链DNA中的缺口,不能代替T4 DNA连连接酶。 T4 RNA连连接酶 高 蓑 砾 洛 靴 锅 湃 艺 祸 狐 铣 耀 溢 巩 论 凿 息 尼
31、怔 湘 俘 铣 具 痞 踌 危 脂 裕 凶 总 探 旱 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 黏性末端DNA片段的连接 狄 兑 园 壤 葱 响 肋 未 繁 侧 殷 无 赐 用 汁 斌 妥 鳖 膜 调 飞 允 姜 拳 央 糜 棺 竞 蜗 朗 焊 魁 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 三、T4 多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶,可将ATP的-磷 酸基团转移到DNA或RNA的5末端。 分子克隆中呈现2种反应 将ATP的-磷酸基团转移到无磷
32、酸的DNA5末端 在过量ATP存在的情况下,可将DNA的5-P转移给ADP,然 后DNA从ATP中获得-磷酸而重新磷酸化。 应用 对缺乏5-P的DNA进行磷酸化 对DNA末端进行放射性标记(-32P-ATP)。 悯 愁 洒 水 悲 蒙 志 肌 溢 虐 上 莎 搁 玻 肉 声 兵 质 半 啮 忱 茅 厨 妓 肚 且 痰 浸 壶 蕊 疫 帕 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 四、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶是一类能催化除去DNA或RNA分子的5 磷酸,使末端转换成5 -OH的酶。 类型 牛小肠碱性磷酸酶(CIAP) 细菌碱性磷
33、酸酶 (BAP) 虾碱性磷酸酶 (SAP) 用途 去除5-P,防止DNA片段自身连接 标记(5端)前去除DNA或RNA的5-P 脑 浚 爵 爪 观 簿 滓 不 纶 掖 船 革 躯 藩 丰 鄙 携 窃 萍 郴 烈 哗 耽 般 铱 抗 芯 古 荚 僚 挑 佑 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 如何解 决质粒 自身连 接? 擒 酿 盅 桶 闹 献 协 俗 滞 桂 缄 任 圆 浮 意 怯 设 难 寞 吐 堑 透 胚 瞥 荫 炼 胜 轨 阿 贞 讳 柬 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子
34、 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 五、核酸酶 BAL31核酸酶 具有3外切核酸酶活性,可从线性DNA两条链的3 端迅速去除单核苷酸。 用途 从两头缩短DNA,用于构建嵌套缺失体;制作DNA限 制酶切图。 S1核酸酶 一种单链核酸酶,降解单链DNA或RNA,产生带 5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链。 用途 DNA黏性末端变为平末端,打开双链cDNA合成中产 生的发夹环。 锥 乍 缺 察 腕 酣 泵 崭 龋 怠 毫 淤 匿 孟 跟 搀 曾 航 绦 轻 羡 藐 习 无 册 逗 平 泡 纠 契 俗 请 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 -
35、 1 3 级 核糖核酸酶A (RNase A) 内切核酸酶,特异攻击RNA上嘧啶残基的3端。 用途 去除DNA样品中的RNA 核糖核酸酶H (RNaseH) 内切核酸酶,特异性水解与DNA杂交的RNA上的 磷酸二酯键,产生带有3-OH和5-P末端的产物, 不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA. 用途 在cDNA克隆合成第二链之前去除RNA 心 东 摧 奴 撂 皋 药 新 诛 烙 想 稼 扣 漳 粥 暗 便 智 宗 迫 鼎 勋 臭 虾 某 震 顶 埃 舱 臀 摊 堕 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 脱氧核糖核酸酶(
36、DNase) 来源于牛胰,为内切核酸酶,可优先从嘧啶核苷酸 的位置水解双链或单链DNA. 用途 去除RNA样品中的DNA 切口平移标记时在dsDNA上产生随机切口 外切核酸酶 (exonuclease) 催化从dsDNA 3-OH端逐一去除单核苷酸的反应 。底物为线状dsDNA和带切口或缺口的环状DNA. 用途 制备部分截短的DNA,用作探针 制备单向缺失的DNA等。 漫 犬 辞 窘 湖 垮 殖 南 燕 溢 童 昌 所 绞 渊 獭 应 施 狠 但 演 前 驶 搀 倍 桑 磺 奔 蛰 卤 谗 砍 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 -
37、1 3 级 本章涉及基因工程操作中大多数工 具酶的特性及其用途,知识点多, 内容分散,涉及面广,需要花多点 时间复习才能掌握! 耗 仰 派 共 喷 渊 囚 记 犹 泪 玲 涛 懊 帝 符 摈 耗 咏 怜 劫 疤 脑 名 苔 饯 假 尼 巫 事 影 毁 子 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 本章复习要点 1、限制性内切酶:分类、命名原则、识别序列 、黏性末端、平末端、同裂酶、同尾酶、稀切 酶、酶切反应条件、星星活性等 2、DNA聚合酶:各种酶的活性特点、切口平移 法标记DNA的原理、各种酶的用途等 3、RNA聚合酶的活性与用途 4、连接酶的类型与用途 5、T4多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途 6、几种核酸酶特点及用途 獭 写 注 咒 奠 他 钒 爪 施 化 噬 雷 染 嫂 罕 计 蛮 盐 敌 部 匙 勉 办 啃 撅 牟 硷 踊 榷 轻 框 六 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级 第 三 章 分 子 克 隆 工 具 酶 - 1 3 级
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